基于网络药理学和分子对接技术探索龟甲治疗骨关节炎的潜在机制

朱香梅，李 晴，石雨荷，朱 珏，童巧珍*，刘湘丹，王 智

(1.湖南中医药大学 药学院，湖南 长沙 410208；2.湘产大宗道地药材种质资源及规范化种植重点研究室，湖南 长沙 410208；3.湖南省普通高等学校中药现代化研究重点实验室，湖南 长沙 410208)

骨关节炎(Osteoarthritis，OA)一种退行性关节疾病，以关节软骨退化、软骨下骨硬化、炎症和滑膜增生等为主要病理特点[1]。主要临床症状包括慢性疼痛、关节不稳定、僵硬和放射性关节间隙狭窄。衰老、关节创伤、肥胖和遗传倾向是骨关节炎形成的重要原因[2]。全世界大约有3亿人患有骨关节炎，其中60岁以上人群中，女性发病率占18%，男性占10%[3]。随着人口老龄化，骨关节炎发病率呈快速上升趋势，是老年人致残的主要原因。目前，西医基础治疗主要以缓解症状及矫正畸形为主，药物治疗以镇痛药和关节局部药物注射为主，手术治疗多以截骨术和关节置换术为主，但治疗效果不佳[4]。中医学认为OA属“骨痹”范畴，肝肾亏虚、筋骨失养为本，风寒湿痰瘀为标，筋骨经脉不通不荣为其主要病机，病理性质多属本虚标实[5]。随着中医药的发展，中药多成分、多靶点的特点在防治骨关节炎过程中占有重要地位。

龟甲为龟科动物乌龟Chinemysreevesii(Gray)的背甲及腹甲，性甘，味咸，具有滋阴潜阳、益肾强骨的功效[6]。龟甲化学成分包括胶原蛋白、氨基酸、脂肪酸、微量元素等，常炮制成龟甲胶来提高免疫功能、延缓衰老，是中高端滋补药材市场的主要产品[7]。研究表明，龟甲可促进软骨细胞Ⅱ型胶原的合成，促进软骨细胞增殖，发挥该作用的物质以龟甲胶为主，进一步研究发现龟甲胶通过调控p38 MAPK、JNK、ERK1/2等基因表达水平，从而减缓骨关节炎的进展[8]。龟甲作为胶类药食同源药材之一，其治疗骨关节炎的物质基础和机理研究进展缓慢。本研究采用网络药理学方法预测龟甲活性成分治疗骨关节炎的作用靶点与通路，并采用分子对接技术对其核心靶点及其相关活性成分进行对接，初步探讨龟甲在关节炎治疗中的作用机制，以期为龟甲治疗骨关节炎的药理研究和临床应用提供依据。

1 数据库

本研究涉及的数据库如表1所示。

表1 本研究涉及的数据库

2 方法

2.1 龟甲活性成分筛选

以“GUI BAN、GUI JIA、ZHI GUI BAN或GUI BAN JIAO”为检索词，利用BATMAN-TCM数据库、TCMID数据库收集龟甲化学成分，并通过查阅相关文献查找数据库未收载的成分，合并去除重复部分，最终确定其活性成分。

2.2 龟甲作用靶点与骨关节炎靶点的筛选

利用Swiss Target Prediction 数据库，收集龟甲化合物靶点，以Probability>0.01进行靶点筛选，最终获得龟甲的作用靶点。在TTD数据库、PharmGkb数据库、OMIM 数据库、Drugbank数据库中以“Osteoporosis”为检索词进行搜索，得到骨关节炎的靶点。

2.3 龟甲治疗骨关节炎潜在作用靶点的筛选及网络构建

将龟甲活性成分与骨关节炎的靶点输入Venny 2.1在线平台，绘制出韦恩图，同时获取两者的交集靶点，这些交集的靶点即龟甲治疗骨关节炎潜在的作用靶点。在Cytoscape 3.8.2软件中导入成分与疾病靶点，构建“药物-成分-疾病-靶点”网络图。

2.4 潜在作用靶点生物过程及通路的富集分析

将在“2.3”项获得的潜在作用靶点通过Uniprot数据库转换成Uniprot ID，导入DAVID数据库进行基因本体论(GO)生物过程(BP)、细胞组成(CC)、分子功能(MF)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路的富集分析。

2.5 蛋白互作(PPI)网络构建与分析

在String数据库“Multiple Proteins”中导入潜在的作用靶点，限定Organism为“Homo sapiens”，设置最低相互作用评分为中等置信度0.4，获得蛋白互作图，下载TSV格式文件保存。在Cytoscape 3.8.2软件中导入TSV文件进行可视化，使用CytoNCA插件筛选龟甲治疗骨关节炎的核心靶点。

2.6 分子对接评估结合潜力

利用iGEMDOCKV2.1软件对龟甲治疗骨关节炎的核心靶点及相对应的活性成分进行对接。首先，在RCSB PDB数据库选定“Homo sapiens”“PDB ID”“Ligand”“Value”进行搜索，以Resolution<2.5、结构复合体中有小分子配体信息、结晶pH值接近人正常生理范围等进行筛选，下载核心靶点PDB格式。从PubChem中下载活性成分的2D结构，通过OpenBabel软件转化成mol2格式保存。将核心靶点PDB及性成分配体mol2格式分别导入iGEMDOCK软件中的Prepare Binding Site和Prepare Compounds，选择标准对接模式：Population size=200，Generation=70，Number of solution=2,进行分子对接[9]。结果以能量高低判断配体与受体的结合程度，化合物分子与受体结合的构象稳定时能量越低，发生作用的可能性越大[10]。

3 结果

3.1 龟甲活性成分

从BATMAN-TCM和TCMID数据库中分别检索到龟甲成分数量为10个和40个，查阅龟甲活性成分研究文献，补充18个，去除未找到靶点和重复的成分后共27个。见表2。

表2 龟甲活性成分信息

3.2 龟甲治疗骨关节炎潜在的治疗靶点

在SwissTargetPrediction 数据库中检索27个活性成分作用靶点，去除重复后共获得314个靶点。经TTD、PharmGkb、OMIM 和Drugbank数据库检索骨关节炎靶点，分别检索到18、9、9和155个疾病相关靶点，筛选去重后共获得180个靶点。通过Venny2.1在线平台对314个龟甲活性成分靶点和180个骨关节炎相关靶点进行交集映射，得到41个共同靶点(图1)，即龟甲抗骨关节炎的潜在作用靶点。在Cytoscape 3.8.2中导入筛选后的药物靶点和疾病靶点，构建“药物-成分-疾病-靶点”网络图(图2)，该网络有482个节点，1 270条边，结果显示，龟甲抗骨关节炎潜在的作用靶点包括：脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)、过氧化物酶体增殖物激活受体δ(PPARD)、基质金属蛋白酶2(MMP2)、组胺H2受体(HRH2)、诱导型一氧化氮合酶(NOS2)、肿瘤坏死因子(TNF)、丝氨酸蛋白酶抑制剂A6(SERPINA6)、醛酮还原酶家族1成员C1(AKR1C1)、胞质磷脂酶A2(PLA2G4A)、过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARA)、多不饱和脂肪酸5-脂氧合酶(ALOX5)、醛酮还原酶家族1成员B10(AKR1B10)、甘氨酸受体亚基α-1(GLRA1)、视黄酸受体α(RXRA)、细胞色素P450(CYP2C19)、葡萄糖醛酸转移酶2B7(UGT2B7)、磷脂酶A2(PLA2G1B)、前列腺素G/H合酶2(PTGS2)、多药耐药相关蛋白1(ABCC1)、磷脂酶A2磷脂酶A2膜相关(PLA2G2A)、皮质类固醇11β脱氢酶同工酶1(HSD11B1)、γ-氨基丁酸受体亚单位α-2(GABRA2)、前列腺素G/H合酶1(PTGS1)、胆碱酯酶(BCHE)、溶质载体家族22成员6(SLC22A6)、谷氨酰胺合成酶(GLUL)、丝裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)、脂肪酸结合蛋白(FABP2)、雄激素受体(AR)、醛酮还原酶家族1成员B1(AKR1B1)、碳酸酐酶2(CA2)、乙酰胆碱酯酶(ACHE)、过氧化物酶体激活受体-γ增殖体(PPARG)、醛酮还原酶家族1成员C2(AKR1C2)、γ-氨基丁酸受体亚基α-1(GABRA1)、前列腺素D2受体2(PTGDR2)、前列腺素E2受体EP1亚型(PTGER1)、ATP依赖性易位酶(ABCB1)、瞬时受体电位阳离子通道亚家族V成员1(TRPV1)、胆汁酸受体(NR1H4)、糖皮质激素受体(NR3C1)。

图1 龟甲-骨关节炎交集靶点韦恩图

3.3 GO生物过程与KEGG通路富集分析

通过DAVID数据库对龟甲治疗骨关节炎的41个潜在靶点进行GO基因功能注释分析，以P<0.05为筛选条件，最后共富集到123个具有统计学差异的生物注释过程，其中生物过程72个、细胞组成17个、分子功能34个，根据P值由小到大的顺序，以气泡图形式呈现排名前15位的功能注释过程，见图3(A)。结果显示，在排名前15的功能注释过程中，主要的生物过程为：RNA聚合酶II启动子的转录起始、氧化还原过程、脂质代谢过程、细胞内受体信号通路、花生四烯酸代谢过程、类固醇代谢过程等，主要细胞组成：细胞器膜、内质网膜、氯离子通道复合体、细胞外间隙等，主要分子功能包括类固醇激素受体、醛酮还原酶(NADP)活性、药物结合、酶结合等。生物过程中的氧化还原过程、细胞组成中的细胞器膜、分子功能中的锌离子结合富集的蛋白最多，结果见图3(B)。

图3 龟甲治疗OA的GO富集分析

通过对41个潜在的作用靶点进行KEGG分析，共富集到33条通路，其中显著富集(P<0.05)的25条。按照P值升序的方式，以条形图的形式展示前20条通路，如图4所示。结果显示，41个潜在作用靶点涉及花生四烯酸代谢、5-羟色胺能突触、PPAR、神经活性配体-受体相互作用、类固醇激素生物合成、戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化及癌症途径信号通路。

图4 KEGG富集分析

3.4 潜在作用靶点的PPI网络构建与分析

将41个潜在作用靶点输入String网站，获得39个相互作用的靶点，导出相互作用数据后利用Cytoscape 3.8.2软件构建蛋白互作网络图，同时用CytoNCA插件对靶基因进行计算每个靶点的Degree值。如图5所示，39个节点共产生122条边，其中圆形越大代表Degree值越大，线条越粗相互作用越强。该网络Degree平均值为6.26，其中超过Degree均值的靶点16个，如图6所示分别为：PTGS2、TNF、MAPK3、PPARG、ALOX5、PTGS1、NR3C1、CYP2C19、PLA2G1B、PLA2G-4A、RXRA、ABCB1、PLA2G2A、PPARA、AR、NOS2。其中PTGS2、TNF、MAPK3的Degree值超过均值两倍分别为21、18、16，可能是龟甲治疗骨关节炎过程中起效的核心靶点。

图5 龟甲治疗OA潜在作用靶点PPI网络

图6 PPI网络核心基因

3.5 i GEMDOCK分子对接结果

筛选PPI网络分析中Degree值大于中位数的核心靶点为：PTGS2(PDB ID：5IKR)、TNF(PDB ID：2QD9)、MAPK3(PDB ID：2ZOQ)、PPARG(PDB ID：1ZGY)、NR3C1(PDB ID：4MDD)、RXRA(PDB ID：3OAP)，将其与相对应的活性成分进行对接，同时选用目前临床应用较多的治疗OA药物双氯芬酸钠(PubChem ID：5018304)、西乐葆(PubChem ID：2662)作对照，研究发现配体与受体结合的构象稳定时能量越低，发生作用的可能性越大，结果见表3。与靶点PTGS2、TNF和NR3C1结合最好的是十四酸甾醇酯，与靶点MAPK3和PPARG较好结合的是(E)-11-二十碳烯酸，与靶点RXRA较好结合的是十五烷酸，且可以看出龟甲活性成分与靶点结合活性普遍高于阳性对照药。运用i GEMDOCK软件进行分析，并将龟甲与关键靶点对接结果可视化，结果见图7。综上可知，龟甲中的化学成分与核心靶蛋白均有较好的结合活性。

注：图片右下角字母代表蛋白配体(PTGS2：ID8、TNF：LGF、MAPK3：5ID、PPARG：BRL、NR3C1：29M)。

4 讨论

龟甲作为药用始载于汉代《神农本草经》，谓“龟甲，味咸平，主漏下赤白、破症瘕核疟、湿痹、四肢重弱……”[11]龟甲胶起源于龟甲，对腰膝酸软、久咳不愈、骨蒸盗汗等有很好的辅助治疗作用，在历版《中华人民共和国药典》中龟甲所制得的各类龟甲胶均有收载。龟甲作为传统的补肾健骨中药，在临床上用于骨病的治疗己有很长的历史。因此，近年来龟甲治疗OA的作用引起了广泛关注，临床研究表明，龟甲散剂、龟甲针对骨性关节炎等骨科疾病，效果显著[12]。现代药理学研究也表明龟甲胶能够修复受损软骨从而延缓骨关节炎的病理进程[13]。

本研究利用网络药理学方法对龟甲治疗OA的作用进行挖掘，结果显示，龟甲包含27个活性成分，对应314个靶点，与OA相关的180个靶点交集映射后获得41个潜在作用靶点。通过构建41个靶点蛋白PPI网络，筛选到了龟甲治疗OA的关键靶点包括PTGS2、TNF、MAPK3、PPARG等。MAPK3属于丝裂原激活蛋白激酶家族成员，与抗炎、抗软骨细胞凋亡有关。有研究发现壮骨健脾汤可以通过抑制MAPK信号通路来预防软骨细胞凋亡，从而治疗骨关节炎[14]。临床研究表明TNF-α水平在OA患者的滑液、滑膜、软骨下骨和软骨中升高，证实了其在OA发病机制中的重要作用[15]。TNF在滑膜组织中诱导一氧化氮(NO)，同时阻断其受体，抑制人软骨中NO的生成。且TNF-α诱导产生其他细胞因子，抑制蛋白多糖和II型胶原的合成，因此TNF-α在OA软骨基质降解和骨吸收中起着关键作用[16]。PTGS2编码环氧合酶-2，具有高度多态性，在人类OA软骨细胞中高表达[17]，对缓解软骨细胞损伤起着重要作用。晚期糖基化终产物(AGEs)在关节软骨中的累积被认为是骨关节炎发展的主要危险因素，AGEs通过与PPARG相互作用激活AKT/MTOR信号通路，诱导软骨细胞自噬维持细胞活力[18]。除去没有配体结构的靶点蛋白，共6个核心靶点进行分子验证，结果发现核心靶点与对应成分对接的能量值大多比阳性对照组低，表明龟甲成分和核心靶点之间的结合活性较高，存在较好的治疗潜力。其中十四酸甾醇酯能量值最低，(E)-11-二十碳烯酸、亚油酸及十五烷酸等能量较低，结合性较好，且整体比阳性药结果好，可能是治疗OA的潜在成分。

41个潜在作用靶点的GO功能富集结果显示，与龟甲治疗OA密切相关的生物过程包括RNA聚合酶II启动子的转录起始、氧化还原过程、脂质代谢过程、细胞内受体信号通路、花生四烯酸代谢过程等。KEGG通路富集结果显示，龟甲的作用途径包括花生四烯酸代谢、5-羟色胺能突触、PPAR、类固醇激素生物合成、戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化及癌症途径信号通路等。研究表明，5-脂氧合酶(5-LOX)介导的花生四烯酸代谢升高可能有助于观察到非甾体抗炎药在OA中的副作用，证实了其在OA的发生发展及治疗中具有潜在作用[19]。PPAR通过调节各种信号通路来调节关节软骨的稳态，减少人体OA软骨的炎症反应[20]。糖皮质激素是由肾上腺皮质合成和释放的类固醇激素，在骨关节炎中，合成糖皮质激素可以很好地减轻炎症和疼痛，主要通过减少胶原Ⅱ的降解，保护分解代谢激活软骨细胞[21]。综上所述，龟甲治疗OA的作用可能与调控炎症、软骨代谢、细胞凋亡等有关。

本研究采用网络药理学方法探究了龟甲与OA的复杂网络关系，运用分子对接证明了龟甲治疗OA的合理性，最终预测了龟甲治疗OA的潜在作用靶点及其作用途径，并筛选了核心靶点，以探讨其可能的分子机制。但是该研究主要依据数据库信息，考虑数据与方法试验存在一定的局限性，龟甲具体作用机制的确认仍需通过进一步实验来对预测结果进行验证。