小红参免疫作用及质量标志物预测分析

张 希，东方梓涵，李 江，戚琬若，刘 旭，邹昱蕾，余晓玲*

(1.昆明市中医医院，云南 昆明 650500；2.吉林农业大学 中药材学院，吉林 长春130118)

小红参，又名滇紫参，别称活血、小活血、小红药、红根、小茜草、小舒筋、色子片等，为茜草科植物云南茜草[Rubiayunnanensis(Franch.) Diels]的干燥根及根茎，是云南、贵州少数民族特色药用植物之一，彝医称其为“乃佐色”，意译为“小红药”[1]。

小红参具有活血通经、祛风除湿、镇静止痛等功效，常用于治疗女性痛经闭经、产后瘀阻、黄褐斑、不孕症，以及跌打劳伤、关节风湿疼痛、咳嗽气喘、头昏脑胀、胃脘痛、心烦失眠等[2]。现代研究明确其药理作用主要有抗心肌缺血、抗肿瘤、抗氧化、抑制NO、治疗银屑病、升白以及祛痰等[3]，临床主要用于皮肤病、外科、心血管、肿瘤及呼吸系统疾病的治疗。近几年关于小红参的临床应用研究主要集中在抗癌、抗心肌缺血以及治疗银屑病等方面。另外，通过查阅文献，发现活血化瘀类中药除了具有较强的抗凝血作用外，还有免疫炎症调节作用，因此本研究以活血化瘀药小红参的主要临床药理作用为研究基础，总结其在免疫调节方面的作用机制，为小红参多靶点药理作用的机制研究提供参考依据。

对中药进行质量控制是临床安全用药的基本保证，目前对于中药质量的分析大多参考药物中单个或多个成分的含量作为质量控制依据，而该成分的选择可能是因为易分离、易指认或含量较大等原因，因此存在药效关联度差、有效成分物质基础不明确以及缺少特定有效成分对药材整体把控等情况。因此，刘昌孝院士提出的中药质量标志物概念，认为质量标志物是中药材和中药产品(包括中药饮片、中药煎剂、中药提取物、中成药制剂)中固有的或加工制备过程中形成的，与中药功能密切相关的化学物质[4]，这些化学物质对于中药质量控制有重要作用[5]。本研究从传统药效、新药效、成分特有性及成分可测性4个方面，对小红参质量标志物(Q-marker)的成分进行分析，现报道如下。

1 小红参的免疫作用

1.1 治疗银屑病的免疫机制

银屑病是一种慢性易复发的炎症性皮肤疾病，其具体发病机制目前仍处于研究中，但可明确的是银屑病是由多基因改变引起的遗传病，是一种以T淋巴细胞免疫介导为主、在多种免疫细胞共同作用下引起的角朊细胞异常增殖性皮肤病[6]。银屑病皮损中先有CD4+T细胞等进入和活化，接着出现CD8+T细胞，当皮损消退时CD8+T细胞又逐渐增多，而皮损中CD4+T细胞减少或消失[7]。吕邵萍等[8]采用小红参针剂对寻常型银屑病患者进行治疗，发现患者病情缓解后，外周血中CD3+、CD2+及CD4+数值均无明显改变，而CD8+T细胞由治疗前异常增高降到正常范围，表明小红参与了T细胞亚群的调节。

适量浓度的小红参提取物有抑制经ConA诱导的T细胞增殖反应及其产生IL-2的能力，且随着给药剂量等增加，对其T细胞产生IL-2的抑制作用增强。但经LPS诱导的B细胞增殖反应无相同抑制效果；体外给药小红参蒽醌类及三萜类对外周血T淋巴细胞增殖反应均具有抑制作用，因此小红参治疗银屑病的作用机制可能是通过蒽醌类及三帖类等免疫活性成分调节T淋巴细胞从而发挥作用[9-10]。

另有研究发现，急性银屑病的诱发及其慢性持续存在的刺激因素都与链球菌感染有关。戴军等[11]研究小红参含药血清干扰链球菌抗原刺激致敏小鼠的免疫细胞，发现其免疫药理学结果提示小红参含药血清有抑制T淋巴细胞对链球菌超声抗原的增殖作用，可抑制炎症因子等释放，并且其醇提取物含药血清的抑制作用更明显，抑制率高达26%。提示小红参含药血清可抑制T淋巴细胞增殖，且可能醇提取物中蒽醌含量较高，抑制效果更好；表明小红参可能从细胞和分子水平抑制免疫炎症反应，从而调节银屑病患者的免疫功能异常。

1.2 抑制NO的免疫机制

一氧化氮(NO)作为信使因子和效应因子，在炎症反应和免疫调节中发挥着重要作用。适量NO可在早期固有免疫应答中直接或间接抑制和杀伤病原微生物[12]，但过量的NO易形成炎症级联动反应，促使炎症发展，导致机体异常[13]。

研究发现，银屑病患者血浆中和皮损处NO含量明显高于正常值，过量的NO会导致血管扩张和炎症因子的释放，且银屑病皮损处的炎症细胞表达iNOS增加，可进一步催化NO生成。顾锦章等[14]对SLE、接触性皮炎、湿疹及银屑病患者血清NO进行检测，发现与正常对照组相比，银屑病患者NO水平明显升高，而经药物干预后下降，表明银屑病的形成机制可能与NO参与炎症介质和免疫调节分子相关。

据报道，小红参含药血清对链球菌抗原诱导的小鼠腹腔巨噬细胞的NO分泌有抑制作用。MORIKAWA T等[15]发现小红参中红芸香醇C、红芸香醇A和F、红芸香酮C、2-甲基1，3，6-三羟基-9，10-蒽醌能抑制NO的产生；小红参根的水-丙酮提取物、乙酸乙酯溶解部分及其从中得到的rubianols-d与rubianols-e的化合物均能抑制脂多糖活化巨噬细胞中的NO。TAO J等[16]实验结果也显示了小红参能抑制脂多糖活化的巨噬细胞中NO的分泌，同时能抑制诱导型一氧化氮合酶的诱导。FAN JT等[17-18]研究了小红参中的茜草素和两个新的环六肽，发现其能抑制脂多糖及干扰素-γ诱导的鼠巨噬细胞中NO的产生。据报道，乔木烷型三萜类化合物能够抑制血小板聚集和NO的产生[19]，而从小红参中分离出的主要三萜类成分茜草乔木醇G(RG)也属于乔木烷型[20]，表明小红参可能通过抑制NO的分泌及iNOS的诱导从而缓解皮损症状，以调节炎症局部的免疫状态，在细胞和分子水平抑制免疫炎症反应。

然而，到目前为止，关于小红参通过抑制NO来调节T细胞的功能及其亚群提高免疫功能的相关研究报道较少，其作用机理及信号通路尚不明确。因此将小红参作为NO、iNOS的抑制剂，研究新的抗炎免疫的治疗途径，具有重要的医疗价值。

1.3 炎症免疫调节机制

小红参具有活血化瘀、养血生新的功效，近几年研究发现小红参在抗心肌缺血(再灌注损伤)、抗癌及抗氧化方面具有良好疗效。

现代研究表明，在缺血性心脏病的发展过程中天然免疫应答具有关键性作用。TLRs被缺血性再灌注损伤的心脏组织激活后产生免疫应答，其主要机制是促进NF-κB活化及炎性因子的产生[21]。NF-κB是介导炎症反应的关键转录因子，也被研究证实与多种炎症性、自身免疫性、肿瘤性疾病的易感性有关[22]。FAN JT等[18]研究发现小红参中rubiyunnanin D、RA-I、RA-V、RA-XXIV、RY-I能显著抑制HEK-293-NF-κB 荧光素酶，稳定细胞中TNF-α诱导的NF-κB活化。ZENG等[20]研究小红参中三萜类化合物茜草乔木醇G(RG)对TNF-α诱导的NF-κB信号传导激活的影响，结果表明，RG可有效抑制NF-κB信号传导激活。另外，小红参中环肽类RA-V也能有效抑制NF-κB通路的激活，诱导癌细胞凋亡，抑制HUVEC和HMEC-1内皮细胞的血管生成[23]。

p65是NF-κB信号通路成分之一，已有研究证实，小红参可通过阻碍NF-κB p65的磷酸化，进而抑制MI/R大鼠心肌细胞凋亡[24]。小红参中三萜类化合物RG可通过下调NF-κB p65的表达，减弱NF-κB p65的转位，从而抑制NF-κB信号通路的激活，进而调控下游p53、cyclin D1、Bcl-2和胱天冬酰胺酶，从而触发HeLa细胞的凋亡和G0/G1阻滞。

Nrf2在细胞各种氧化应激损伤调节中具有重要作用，其在氧化应激作用下被激活，致使下游HO-1的表达，通过抗炎、抗氧化和调节细胞凋亡，对心血管疾病起到保护作用[25]。RA-XII为小红参中分离得的一种天然环肽，XUSHENG AN等[26]研究发现RA-XII可通过阻断Nrf2和HO-1调控的IκBa/NF-κB和MAPKs信号通路，抑制氧化应激和炎症反应，延缓LPS诱导的炎症模型小鼠死亡，并能增强肾组织切片中HO-1和Nrf2的表达。体外研究表明 Nrf2和HO-1抑制后，RA-XII的抗炎作用被部分逆转。此外，RA-XII暴露可明显降低促炎细胞因子的释放，包括白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-6和IL-8，并抑制IκB/NF-κB和MAPK等磷酸化。

通过对小红参相关药理活性机制的深入研究探讨，发现小红参的多种活性成分可通过调节NF-κB、TNF-α、HO-1、Nrf2、IL-1β、IL-2、IL-6和IL-8等靶点发挥其抗炎作用，而这些靶点在小红参抗癌、抗氧化以及抗心肌缺血等药理活性中发挥着重要作用，且这些靶点均为免疫炎症调节中的重要靶点。表明小红参可能参与了对免疫系统的修饰及对炎症反应的调控，且可能发挥了重要作用。

2 小红参质量标志物预测分析

本研究主要从传统药效、新的药效、成分特有性及成分可测性4个方面对小红参质量标志物(Q-marker)进行分析。

2.1 基于传统药效的质量标志物预测分析

小红参功效主要在于活血祛瘀生新、通络镇静止痛，可对应用于心血管、肿瘤、外科、妇科、皮肤科等方面的疾病。小红参提取物Ⅱ-A可提高小鼠ATP含量及耐氧能力[27]，乔木烷型三萜类和游离蒽醌具有降血脂活性[28]，1，2-二羟基蒽醌和1，3，6-三羟基-2-甲基蒽醌可抗血小板聚集，茜草酮A与茜草醇A在低浓度时呈现出抗血小板聚集活性[29]，这与小红参在治疗心血管疾病与传统药效的活血祛瘀功效一致。小红参醌、环已肽配糖体、RY-I及RY-I的苷元RA-V、RY-II具有抗癌活性[30-31]，MTA可诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡[32]，具有抗肿瘤活性。茜草乔木醇G(RG)对人类7种癌细胞系表现出强大的细胞毒性[33]。小红参中的环己肽类化合物能抑制腹水癌(艾氏)、结肠癌、Lewis肺癌、实体癌、B-16黑色素瘤和白血病等[34]。FAN JT等[18]发现小红参中的茜草素和环六肽均能抑制癌细胞毒性，RA-I、RA-V、RY-I、RY-II、RA-XXIV、rubiyunnanin B-H对11种癌细胞株呈现出细胞毒性，且rubiyunnanin B依赖于融合的络氨酸残基的糖基化而表现出显著的抗癌谱，表明小红参中蒽醌类、三萜类的茜草乔木酮、茜草乔木醇及环己肽类成分可作为传统药效的质量标志物成分。

2.2 基于新药效的质量标志物预测分析

通过总结小红参的药理作用可知，其提取物Ⅱ-A可以升高白细胞[35]，小红参醌具有抗氧化和抑制肠道细菌易位作用，茜草酮A(1)能抑制枯草芽孢杆菌活性[36]，红芸香醇C、红芸香醇A和F、红芸香酮 C和2-甲基1，3，6-三羟基-9，10-蒽醌、乔木型三萜、茜草素及环肽类能抑制NO 的产生；蒽醌类提取物及三萜类可抑制T淋巴细胞增殖。2-甲基1，3，6-三羟基-9，10-蒽醌对RBL-2H3细胞中β-己糖胺酶的释放表现出抑制活性作用[16]，表明小红参中这些化合物可作为新的药效质量标志物成分。

2.3 基于成分特有性的质量标志物预测分析

一般来说，成分“特有性”体现在2个不同层次：①能代表和反映同一类药材的共有性并区别于其他类药材的特征性成分；②能反映同一类、不同种药材之间的差异性成分，可分为种类和含量两个层次[37]。但这只是表明了可测性，中药本身是复杂的化合物组合，中药本身的次生代谢产物和机体吸收过程中产生的内、外源性代谢产物也可作为成分“特有性”的指标之一，但目前关于其代谢产物鲜有报道。迄今报道的小红参化学成分主要有蒽醌类、乔木烷型三萜类、环己肽类等，及少量香豆素、木脂素、芳香酸、甾体醇等成分类型[38]，其中小红参醌、小红参醌苷、小红参醌丙等总蒽醌类为其特征性成分，但近几年，有学者开始对其环肽类产生兴趣，这可能会成为小红参进一步开发的特有性成分之一。

2.4 基于成分可测性的质量标志物研究

关于小红参的标准目前有《中国药典》(1977年版一部)、《贵州省中药材质量标准》(1988年版)、《云南省中药材标准》(2005年版，第二册彝族药)、《湖南省中药材标准》(2009年版，现行标准)。《中国药典》自1977年后的版本未对其收录，近几年地方标准也未有更新，现行标准也只对小红参的基源、性状、显微、水分、灰分、酸灰及浸出物作了规定，但缺少关于其的定性和定量研究。李准[39]分别采用RP-HPLC和分光光度法测定小红参醌苷和小红参总蒽醌的含量，并通过分离鉴定出化合物1-羟基-4-O-β-D-葡萄糖萘酚苷，其余关于小红参标准指纹图谱及其特征性成分的检测未见相关研究报道。因此，为了民族药小红参更好的挖掘利用，需要对其质量标准及其代表的指标性成分进行深入研究。

3 结语

近年来，越来越多的研究报道提示中药及中成药在免疫调节及抗炎方面具有较好的疗效，并且认为活血化瘀类中药在防治心血管疾病的过程中，除了有抗凝血作用外，还可能参与了免疫系统的修饰及对炎症反应的调控。小红参作为活血化瘀类民族药目前已用于抗肿瘤、抗心肌缺血、抗氧化、治疗银屑病等多种方面，但通过对小红参治疗病症相关机制的深入研究，发现其可能通过调节相关炎症介导因子，抑制多个活性靶点来终止和缓解炎症反应，从而达到治疗效果。总体而言，小红参在治疗疾病方面运用广泛，涵盖了外科、妇科、呼吸系统、循环系统等，但是关于其相关治疗机制及其药效物质基础尚不太明确，更多局限于某一类或某一部位成分，缺少“谱-效-量”之间的相关性研究。

本研究还对小红参的质量标志物进行了预测分析，发现小红参的主要活性成分包括小红参醌、2-甲基-1，3，6-三羟基-9，10-蒽醌、茜草乔木醇G、茜草乔木酮(a、b、乙、丙等)及环肽类等，由于小红参本身成分复杂且有效物质含量较少，没有特定明确的物质基础成分，并且小红参的质量标准不统一，缺少与现代技术接轨的相关分析研究，更多局限于简单的基础鉴定；另外，小红参本身的生长范围有限，大多集中在西南、西部一带，这也为药材标准的建立增加了难度。因此，为了进一步明确小红参的质量标志物成分，需要对小红参的化学成分做进一步研究。

近几年，民族药的临床应用研究逐渐增加，其功效被逐渐发掘，其药用范围也逐渐扩大。小红参作为活血化瘀药的免疫调节作用机制目前仍处于初步研究阶段，还有很大的探索开发空间，值得继续深入研究。作为重要的云南民族药用植物之一，小红参不能局限于作为地方药材使用，其传统药效和新药效的挖掘利用都具有重要的研究价值和广阔的应用前景。