三叶青HPLC指纹图谱研究及多成分含量测定

李士敏，刘京骅，杨颖欣，孙崇鲁，张煜炯

(浙江药科职业大学，浙江 宁波 315100)

三叶青(TetrastlgmahemsleyanumDiels et Gilg.)为葡萄科崖爬藤属，是我国特有草本植物，2018年2月入选新“浙八味”，成为重点培育品种。中医学认为三叶青具有清热解毒、活血止痛等功效，内服对小儿高热惊厥、肝炎、扁桃体炎等疗效显著；外用可治毒蛇咬伤、跌打损伤等[1]。三叶青作为民间用药，目前尚未被国家标准收录，但浙江省中药饮片炮制规范(2015年版)将其收载，该质量标准中将浸出物含量作为定量质量控制指标。

有研究报道，三叶青中富含黄酮、多酚、多糖、有机酸类等，以及Mg、Fe、Mn等多种微量元素[2-7]。目前针对三叶青质量评价的研究主要集中于黄酮类或酚酸类成分的含量测定[8-10]，而对不同种类化学成分、不同产地三叶青的质量比较研究较少。当前，指纹图谱结合多组分含量测定方法已广泛应用于中药材的质量控制、来源分析及差异标记物筛选等方面[11-13]。基于此，本研究采用HPLC法，建立三叶青HPLC特征指纹图谱，并对其中山柰酚(KA)、紫云英苷(AS)、槲皮素(QU)、山柰酚-3-O-芸香糖苷(KR)(黄酮类)、绿原酸(CA)(有机酸类)、白藜芦醇(RE)(多酚类)以及虎杖苷(PO)(醌类)等7种活性成分含量进行测定，为三叶青药材质量控制指标的建立与整体质量控制提供参考。

1 仪器与试剂

仪器：Agilent高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；ODS色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，美国Agilent公司)；超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；超纯水仪(美国CASCADA公司)；万分之一分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；中药粉碎机(温岭市大德中药机械有限公司)。

试剂：甲醇、乙腈(HPLC级，美国TEDIA公司)；CA(含量≥99.4%，批号：20100210)、AS(含量≥98.0%，批号：20022087)、PO(含量≥99.8%，批号：20100216)、RE(含量≥99.9%，批号：20021134)、KR(含量≥98.0%，批号：20100411)、QU(含量≥98.5%，批号：18022608)、KA(含量≥98.0%，批号：18100261)7种对照品均购自上海源叶生物科技有限公司；三叶青样品产于云南、贵州、重庆、湖南、广西、浙江和福建等地(样品信息见表1)，所有样品经浙江医药高等专科学校彭昕博士鉴定为葡萄科崖爬藤属三叶青(TetrastlgmahemsleyanumDiels et Gilg.)的块根。

表1 不同产地三叶青样品信息

2 方法

2.1 样品溶液制备

精密称取样品粉末(过60目筛)1.0 g，加甲醇(80%，V/V)25 mL，超声(300 W，40 ℃)提取60 min，滤过，滤渣用同浓度甲醇25 mL重复提取1次，合并提取液，水浴浓缩至10 mL，经0.45 μm滤膜过滤，备用。

2.2 对照品溶液制备

精密称取7种对照品适量，用甲醇溶解，制得CA浓度为1.06 mg/mL，PO浓度为1.21 mg/mL，KR浓度为5.4 mg/mL，AS浓度为2.36 mg/mL，RE浓度为0.62 mg/mL，QU浓度为8.3 mg/mL，KA浓度为0.89 mg/mL的混合溶液。置于4 ℃冰箱中保存，备用，临用前经0.45 μm滤膜滤过。

2.3 色谱条件

色谱柱为Agilent SB-C18柱；流动相组成为A相：乙腈，B相：0.1%磷酸溶液，梯度洗脱：0 min，10%乙腈；0～30 min，10%～30%乙腈；30～40 min，30%～95% 乙腈；40～45 min，95%乙腈；45～60 min，95%～10%乙腈；流速：0.8 mL/min；检测波长320 nm；柱温25 ℃；进样量10 μL。上述条件下，CA、PO、KR、AS、RE、QU、KA等7种成分分离良好(见图1)。

注：1.绿原酸；2.虎杖苷；3.山柰酚-3-O-芸香糖苷；4.紫云英苷；5.白藜芦醇；6.槲皮素；7.山柰酚。

2.4 方法学考察

2.4.1 重复性试验 按“2.1”项下方法制备样品 6 份，按“2.3”项下色谱条件测定CA、PO、KR、AS、RE、QU及KA的峰面积，计算其峰面积的RSD分别为1.5%、1.1%、1.6%、1.8%、1.6%、1.3%、0.94%，表明本方法的重复性良好。

2.4.2 稳定性试验 按“2.1”项下方法制备供试品溶液。在室温下放置0、2、4、8、12、24 h，按“2.3”项下色谱条件测定CA、PO、KR、AS、RE、QU及KA的峰面积，7种活性成分峰面积的RSD分别为1.9%、1.4%、1.5%、1.6%、1.5%、1.5%、1.8%，表明供试品在24 h内稳定。

2.4.3 精密度试验 取“2.2”项下的混合对照品溶液，按“2.3”项下色谱条件重复进样6 次，记录CA、PO、KR、AS、RE、QU及KA的峰面积，结果7种对照品峰面积的RSD分别为1.0%、0.9%、0.8%、1.0%、1.2%、1.5%、1.0%，均小于2%，表明仪器精密度良好。

2.4.4 线性关系考察 取“2.2”项下制备的对照品溶液适量，用甲醇稀释至不同倍数，摇匀，分别取10 μL注入高效液相色谱仪，按“2.3”项下色谱条件进行测定，以混合对照品浓度为横坐标(X)，测得的峰面积作为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，计算得回归方程及相关系数见表2。

表2 7 种成分的线性关系及线性范围

2.4.5 加样回收率试验 精密称取已知含量的三叶青样品粉末1.0 g，平行6份，按“2.1”项下方法制备样品溶液，精密加入“2.2”项下的混合对照品溶液适量，按“2.3”项条件测定。计算平均回收率(见表3)，结果表明方法加样回收率良好。

表3 回收率试验结果

2.4.6 含量测定 按“2.1”项下方法制成供试品溶液，分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，按“2.3”项条件测定，含量测定结果见表4。

表4 13批三叶青药材中7 种成分的质量分数 (n=2)

2.5 三叶青HPLC 指纹图谱分析

2.5.1 HPLC-UV特征图谱建立 将13 批三叶青样品，按“2.1”项下方法，制备供试品溶液，按“2.3”项下方法测定，记录色谱，将色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(国家药典委员会2012版)，选定S-1号样品色谱为参照图谱，设定时间漂移值为0.1，采用平均数法谱峰多点矫正生成三叶青对照图谱，叠加图谱及对照图谱(见图2)，将该对照图谱的相似度值定为1，计算不同产地样品特征图谱的相似度。

图2 不同产地三叶青HPLC指纹图谱

2.5.2 共有峰的确认与归属 对色谱图进行整体分析，共标识出17个共有峰，共有峰的峰面积之和大于85%。对照确认对照品出峰时间，确定其中2号峰为CA，10号峰为PO，11号峰为KR，12号峰为AS，14号峰为RE，15号峰为KA。

2.5.3 相似度分析 将13批三叶青样品与生成的对照指纹图谱相比较，各批次三叶青样品的相似度在0.537～0.986之间，样品S3、S5、S10、S12相似度在0.8以下；样品S4、S6相似度在0.9以下；其余样品相似度在0.9以上。见表5。

表5 13 批三叶青相似度分析结果

3 讨论

3.1 色谱条件优化

流动相组成：考察甲醇、乙腈和水不同组合洗脱下的分析结果，结果显示乙腈与水组成的流动相洗脱效果更好，得到的色谱图色谱峰数目最多。当在水相中加入少量磷酸后，色谱峰分离效果变得更好，采用乙腈-0.1%磷酸水溶液按梯度洗脱时，基线波动较缓，各成分色谱峰保留时间适中且数量最多。故流动相组成确定为乙腈-0.1%磷酸水溶液。

检测波长选择：7种对照品溶液均为无色，故实验采用DAD检测器在200～400 nm波长范围内进行扫描发现，7种对照品溶液在320 nm波长下测定吸光度最大，且在此波长下供试品溶液的色谱峰数目最多，因此选择320 nm作为检测波长。

3.2 样品含量测定结果及分析

含量测定结果显示，三叶青中7种活性成分含量差异较大，AS含量在0.010～0.097 mg/g之间，QU含量在0.004～0.266 mg/g之间，KR含量在0.039～0.929 mg/g之间，CA含量在0.010～0.143 mg/g之间，RE含量在0.003～0.129 mg/g之间，KA含量在0.001～0.046 mg/g之间，PO含量在0.001～ 0.065 mg/g之间。现代药理学研究表明，AS有抗炎、抗氧化和保护心肌的功能[14]。QU具有抗抑郁、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗菌、免疫抑制、神经保护等多种药理学活性[15]。KA及其衍生物KR具有抗炎、抗氧化、抗惊厥、抗抑郁、抗痴呆，以及对缺血脑组织的保护作用等多种生物学活性，而其神经保护作用尤为关注[16]。CA具有抗炎、抗氧化、抗微生物等多种生物活性[17]。PO具有抗血栓、抗动脉硬化、改善心肌损伤、抗休克以及调节糖脂代谢等多方面的药理活性[18]。RE对非酒精性脂肪性肝炎、糖尿病等代谢性疾病具有保护作用[19]。从整体看，13批样品中，KA和PO含量较低，而KR、CA、RE和AS的含量差异较大；从单个化学成分看，三叶青中AS、QU、KR等7种化学成分的含量差异很大，这可能是受采集时间的影响所致[20]。

本研究建立了三叶青的HPLC指纹图谱，并建立了7种活性成分的含量测定方法，可用于三叶青药材质量评价或其制剂质量控制。