基于生物信息学数据库探究甲状腺结节、乳腺结节、子宫肌瘤疾病间的病变关联

方 琼，钱卫斌，郭丛丛*

(1.山东中医药大学，山东 济南 250355；2.山东中医药大学附属医院，山东 济南 250014)

甲状腺结节、乳腺结节、子宫肌瘤是多发于育龄期妇女的3种独立疾病，其与女性月经初潮、妊娠和绝经时间息息相关。近年来，这3种疾病在女性患者中发病率逐年增高，且常常合并存在。研究发现，子宫肌瘤患者甲状腺结节的发生率是正常女性的1.93倍，乳腺纤维瘤的发生率是正常女性的2.17倍[1]。吴俊芳[2]通过总结83例女性患者的 B 超检查结果发现，乳腺结节患者甲状腺结节的发病率为正常对照组的2.69倍。王营营等[3]研究发现，超声检测出甲状腺损害(甲状腺弥漫性损害和甲状腺结节)患者同时伴有乳腺增生或子宫肌瘤阳性率为94.3%。从现代医学角度而言，乳腺、子宫与甲状腺同属激素反应性器官，受下丘脑-垂体-腺体轴调控，但3种疾病间的病变分子机制尚不完全清楚。从中医理论角度讲，汪涛等[4]认为这3种疾病均属于足厥阴肝经病证，治疗当从“肝”论治。随着生物信息学及网络数据库的不断发展，基于特定生物医学数据库，挖掘疾病间的关联网络可客观描述疾病间的内在关系。此外，基于网络药理学方法可将中药成分、靶点与疾病间相互作用联系起来，从而揭示中药对机体的复杂作用机制[5-6]。笔者基于医学数据库，尝试以“共有靶基因”为联系点，分析上述3种疾病的内在分子关联。借助网络药理学方法，围绕靶点-通路、靶点-中医症状、靶点-中药治疗等方面，阐释中医治疗甲状腺结节、乳腺结节、子宫肌瘤的潜在分子靶点及成分物质基础，为今后中医药研究提供方向。

1 方法

1.1 甲状腺结节、乳腺结节、子宫肌瘤疾病靶点获取

分别在DisGeNET(http：//www.disgenet.org)、 Gencards(http：//www.genecards.org/)、CooLGeN数据库(http：//ci.smu.edu.cn/CooLGeN/)输入“Thyroid nodule”“Breast nodule”或“mammary gland nodule”“uterine leiomyomas” 或“uterine fibroid” “Hysteromyoma”等关键词获得甲状腺结节、乳腺结节及子宫肌瘤的相关作用靶点。

1.2 共同靶点网络分析

Metascape(http：//metascape.org/)为一个整合了GO、KEGG、Drugbank等多个数据库，可用于生物过程注释和通路分析的综合数据库，能较大程度保证数据的时效性[7]。采用 Metascape对甲状腺结节、乳腺结节、子宫肌瘤的共有靶点进行分析，设置物种为人。保留KEGG 通路分析的结果，根据log(P-value)的大小对结果进行排序，保留排名靠前的结果。

将共同靶点导入String数据库(https：//stringdb.org/)中获取蛋白-蛋白相互作用关系，并用Cytoscape 3.7.2软件绘制蛋白相互作用网络。为进一步确定该网络的关键基因，利用network analyzer计算出该网络平均最短路径长度(Average shortest path length)、介数(Betweenness centrality)、自由度(Degree)等参数，以估计各共有靶点在该网络中的重要性。利用Degree值及R加权平均最短路径长度和介数筛选出3种疾病的20个关键基因。R值具体计算公式如下[8]：

R=[Xi-Xi(min)]/[Xi(max)-Xi(min)]×0.5+[1/Xj-1/Xj(min)]/[1/Xj(max)-1/Xj(min)]×0.5

其中，Xi是平均最短路径长度，Xj是介数。R值越小，节点在网络中的作用则越重要。

1.3 关键靶点的中医症状分类及治疗中药筛选

SymMap数据库(https：//www.symmap.org)将现代医学常用的499种草药、961个中医症状、5 235种疾病、19 595种草药成分和 302种基因相联系，构建了一个包含中医症状图谱的综合数据库[9]。本研究中，笔者将3种疾病共有的20个关键靶点导入SymMap数据库，获得与关键靶点相关的中医症状及草药成分，并构建靶点-中医症状网络及靶点-成分数据库。其中，生物利用度OB≥30%的成分被纳入网络分析。

2 结果

2.1 甲状腺结节、乳腺结节、子宫肌瘤3种疾病共有靶点获取及通路分析

通过向 DisGeNET、Gencards、CooLGeN 数 据 库 输 入“Thyroid nodule”“Breast nodules”及“uterine leiomyomas”等关键词筛选疾病相关靶点，去除重复靶点后，分别获得甲状腺结节相关靶基因1 912个，乳腺结节相关靶基因2 332个，子宫肌瘤1 064个。将上述3种疾病的相关靶点取交集发现，甲状腺结节与乳腺结节的共同靶基因有1 852个，甲状腺结节与子宫肌瘤的共同靶基因有548个，乳腺结节与子宫肌瘤的共同靶基因有573个。即甲状腺结节与乳腺结节的相关性可能高于与子宫肌瘤的相关性。如图1A所示，3种疾病的共同靶基因有537个。

将3种疾病共有的537个作用靶点通过Metascape数据库进行KEGG通路注释分析。如图1B所示，537个靶点主要作用于pathways in cancer、age-rage signaling pathway in diabetic complications、proteoglycans in cancer、cytokine-cytokine receptor interaction、HIF-1 signaling pathway、fluid shear stressand atherosclerosis、non-alcoholic fatty liver disease、estrogen signaling pathway等20条通路，涉及肿瘤、糖尿病、非酒精性脂肪肝、动脉硬化、炎症反应、缺氧、雌激素信号通路等。

注：1A.甲状腺结节、乳腺结节、子宫肌瘤3种疾病共有靶点获取；1B.共有靶点的KEGG分析。

2.2 共有靶点蛋白-蛋白相互作用网络的构建及关键靶点筛选

将537个共有靶点导入String数据库中，获取共同靶点蛋白-蛋白相互作用关系。以此为网络背景，利用Cytoscape 3.7.2 软件构建网络。该蛋白-蛋白相互作用网络共涉及530个节点，18 304条边。节点表示共有靶基因，边表示靶蛋白间的关联。利用Network Analyzer分析得到该网络的平均Degree值=69.072 61。筛选大于Degree值2倍的靶基因，初步得到61个共有关键靶点。为进一步确定这3种疾病的关键基因，笔者以R为评分标准，对这61个共有关键靶点进一步筛选。如图2A所示，节点越大，代表该节点Degree值越大，节点的颜色越深，代表该节点的R值越小，即该节点在网络中的地位越重要。基于Degree值及R值，获得了3种疾病的20个关键作用靶点，具体信息如表1所示。

注：A.61个共有靶点的蛋白-蛋白作用网络；B.关键靶点-中医症状作用网络。

表1 3种疾病的20个共有关键靶点信息

2.3 关键靶点的中医症状及治疗中药分析

中医学提供了大量中药天然产物用于治疗的临床症状信息，这些症状对临床诊断和治疗至关重要。SymMap数据库将中医症状、草药成分及疾病治疗靶点相关联，为中医学研究设计方案提供了线索和方向。如图2B所示，通过检索SymMap数据库，获得16个靶点所对应的154种中医症状。这些中医症状涉及：多种痛症(头痛、胸痛、肋痛、肌肉痛、经期产后腹痛等)，肿块(瘿瘤、皮下结节、乳腺增生等)，血症(斑疹、胃出血、便血、贫血等)，热证(口疮、牙龈肿痛、粉刺等)，消化道不适症状(脘痞、嘈杂、呕恶、泛吐清水等)，精神神经症状(癫狂、抽搐、昏迷、头晕目眩等)，头面五官症状(目暗昏花、不能久视、耳聋、脱发)，关节不适(关节肿痛、僵硬、腰膝酸冷)，以及发热、懒言、浮肿、肥胖、四肢无力等全身症状。根据中医气血津液辨证，这些症状主要涉及血瘀、火热、痰湿病机。根据中医脏腑病机辨证，这些症状病变部位主要在肝。根据经络辨证，这些中医症状多见于足厥阴肝经。

通过检索SymMap数据库，以OB≥30%为筛选条件，获得17个关键靶点(EGF、EGFR、IL6、INS、MYC、TNF、TP53、VEGFA、FN1、CCND1、ESR1、MMP9、MAPK3、PTEN、SRC、CTNNB1、AKT1)所对应的564个成分。其中，484种中药成分可能影响ESR1基因的表达。这表明大多中药治疗这3种疾病的分子作用机制可能与调节雌激素受体的生物学效应相关。此外，笔者还发现：影响关键靶点数目最多的前4个成分分别是：槲皮素(Quercetin，Degree=13)、木犀草素(Luteolin，Degree=9)、汉黄连素(Wogonin，Degree=7)、漆树黄酮(Fisetin，Degree=7)。中医治疗疾病往往通过多靶点、多通路发挥作用。本研究发现仅这4个成分即可作用于3种疾病的13个关键靶点，影响13个靶点相关的蛋白-蛋白作用网络。如图3所示，这13个关键靶点所对应的生物学功能涉及：上皮细胞及平滑肌细胞增殖、细胞凋亡、乳腺小泡发育、蛋白磷酸化以及一氧化氮合成。将这4个成分与SymMap数据库中的中草药进行匹配，最终获得263味包含上述成分的草药。鉴于中医药多成分、多靶点治疗特色，本研究选出包含≥2个成分的草药43味。经分析发现：这43味中药以清热泻火解毒、祛湿化痰及化瘀类药为主，涉及补阳药、补阴药及温里药。此外，本研究还发现，临床治疗甲状腺结节、乳腺结节、子宫肌瘤的常用复方(小柴胡汤及桂枝茯苓丸)中的多味中药含有槲皮素。具体讲，柴胡、半夏、人参、甘草、大枣、桂枝、牡丹皮、桃仁均含有槲皮素，黄芩含有汉黄连素。该结果佐证了通过此方法筛选出的中药针对3种疾病的治疗效果。

3 讨论

3.1 从现代医学角度分析3种疾病间的分子机制关系

共有靶点KEGG通路分析显示，甲状腺结节、乳腺结节及子宫肌瘤与雌激素信号转导通路密切相关。研究证实，3种疾病病变组织均异常高表达雌激素受体(Estrogen receptor，ESR1)，高雌激素水平是甲状腺结节、乳腺结节及子宫肌瘤的共同危险因素[10-12]。应用雌激素受体拮抗剂能抑制甲状腺肿大及子宫平滑肌增生[13-14]。本研究还发现，这3种疾病与肿瘤通路的激活密切相关。研究发现，甲状腺功能减退会增加绝经后妇女乳腺癌发生率[15]。乳腺癌患者可检测到甲状腺激素及抗体的变化幅度与乳腺癌病变严重程度相关[16]。王新云等[17]研究发现，有子宫肌瘤病史的妇女中患乳腺癌的风险增加。此外，本研究还发现这3种疾病与

图3 关键靶点-成分-中药-功能分析作用网络

糖尿病、胰岛素相关通路也密切相关。研究发现，在女性患者中胰岛素抵抗是甲状腺结节的独立危险因素[18-19]。胰岛素自身亦可促进甲状腺细胞增殖。胰岛素还可通过胰岛素生长因子(Insulin-like growth factor I，IGF-1)受体促进甲状腺细胞的增殖抑制其凋亡[20]。高胰岛素血症及IGF-1对子宫也有类似作用[21]。这些研究提示，上述3种疾病是体内内分泌紊乱的信号，应引起足够的重视，防止疾病发生及进展。

3.2 从中医理论角度分析3种疾病间的病因病机关系

甲状腺结节、乳腺结节、子宫肌瘤分属中医“瘿瘤”“乳核”“石瘕”范畴，皆为有形实体。清代名医唐容川云：“积聚之证，此非凝痰，即是黑血”；《丹溪心法》谓：“凡人身上中下有块者，多是痰”。本研究发现，这3种疾病共有关键靶点所匹配的中医症状与血瘀、痰湿、火热的中医病机密切相关。血瘀的病机特点为疼痛，痛有定处，甚则可形成肿块、出血。本研究归纳的症状有多种痛症、肿块及出血症状。湿性重着黏滞，易阻遏气机，湿邪留滞经脉可致抽搐。湿犯上焦，则咳喘；湿阻中焦，则脘腹胀满、泛吐清水，脘痞呕恶；湿滞下焦，则便溏、小便不利；水湿泛溢则致水肿、湿疹、瘙痒。若水湿无以运化，则聚积生痰。随着病机转化，痰湿、瘀血均可郁而化火，火性炎上，可见口疮、粉刺、牙龈肿痛、疮疡等症状；火扰心神，则五心烦热。由此推断，甲状腺结节、乳腺结节、子宫肌瘤及其他相关疾病是机体血瘀、痰湿、火热内郁病理状态的集中体现。若火、痰、瘀之邪日久不散，蓄久化毒，形成热毒、痰毒、瘀毒，相互兼夹，相互转化，则这3种疾病易形成变证，严重危害健康。

本研究发现，甲状腺结节、乳腺结节、子宫肌瘤的关键靶点所匹配的中医症状主要病位在“肝”。《圣济总录·瘿瘤门·诸瘿统论》云：“忧恚劳气，郁而不散……此瘿所为作也……妇人多有之，缘忧恚有甚于男子也。”可见，气机郁而不散是瘿病的关键病机。《外证医案汇编》曰：“乳症，皆云肝脾郁结，则为癖核。”《妇科玉尺》云：“妇人积聚之病皆血之所为。盖妇人多郁怒，郁怒伤肝，而肝藏血者也。”故肝气郁结是瘿病、乳核、石瘕的关键成因。再者，肝主疏泄，可助脾运化，助胃受纳腐熟，若肝失疏泄，犯脾克胃，则出现脘痞、嘈杂呕恶、胃脘痛等症状。肝喜条达，内寄相火，主动主升，易于阳亢，易于动风。若肝气升发不及，则两胁胀痛。若肝气升发太过，则头晕目眩、头痛头胀、抽搐、惊痫。肝主藏血，若肝不藏血，则可见出血等症。肝开窍于目，若肝失所养、疏泄不及则目暗昏花、不能久视，视力减退。肝气升发太过，则目赤翳障。肝藏血，肾藏精，肝肾同源，精血互生。肝主筋，肾主骨；肝肾阴虚，则见关节肿痛、僵硬、骨质增生。《素问·阴阳应象大论》言：“肾生骨髓，髓生肝”，《灵枢·海论》言：“脑为髓之海”，清代陈士铎《辨证奇闻·卷三》云：“脑气不足，则肝之气应之，肝气大虚，不能应脑”，肝肾不足，则思维迟缓。从经络角度讲，《灵枢·经脉》云：“肝足厥阴之脉……上腘内廉……过阴器，抵小腹，挟胃，属肝，络胆，上贯膈，布胁肋，循喉咙之后，上入颃颡，连目系，上出额，与督脉会于巅；其支者，从目系下颊里，环唇内；其支者，复从肝，别贯膈，上注肺。”足厥阴肝经为肝之外延，甲状腺、乳腺、子宫均处于足厥阴肝经的循行部位。此外，关节、口唇、咽喉、眼睛、脑、胸胁、肺等部位也为肝经所过。基于以上分析，本研究将3种疾病关键靶点所匹配的中医症状主要病位归于“肝”。由此可知，中医理论可用现代分子生物学理论部分解释，该结果进一步证明了靶点-中医症状网络构建的可行性。

3.3 治疗

本研究发现，槲皮素可能对3种疾病均有一定治疗作用。研究证实，槲皮素可激活PI3K-AKT通路，抑制甲状腺细胞生长[22]，逆转乳腺癌细胞他莫昔芬耐药[23]。研究发现，低剂量槲皮素还可拮抗雌激素效应，抑制子宫肌瘤细胞增殖[24]。但槲皮素的临床疗效及安全性有待进一步确证。

山东中医药大学附属医院钱秋海教授认为，甲状腺结节、乳腺结节、子宫肌瘤均属内分泌系统紊乱疾病，属多发结节体质，当以治肝论治。治疗此类疾病时，常用小柴胡汤为底方，配以化瘀散结、祛湿化痰、清热解毒之品。活血散结之品常选用皂角刺、桃仁、丹皮、桂枝、丹参。祛湿化痰之品则根据湿邪所困部位，灵活选用白豆蔻、香薷化湿；黄连、黄芩、黄柏燥湿；石韦、虎杖利湿。肝郁气滞重者加香附；肝郁化火者加焦栀子、莲子心、夏枯草；热毒蕴结者宜用清热解毒法，常用连翘、金银花、半枝莲解毒散结；咽部不适者加山豆根、木蝴蝶；目赤翳障者加木贼、谷精草；皮肤瘙痒、湿疹瘙痒者加白鲜皮、苦参、荆芥。这些临床经验用药与生物信息数据库归纳结果相近。此外，饮食调节也是多发结节体质治疗的关键和基础。多发结节体质患者应少食含碘、含盐过高、肉类及辛辣刺激食物，倡导患者形成清淡饮食习惯。

综上，本研究结果提示，对于甲状腺结节、乳腺结节及子宫肌瘤这3种独立疾病，应持整体观念，综合治疗。在临床诊疗中，如遇女性甲状腺疾病患者，除检查甲功、甲状腺相关抗体、甲状腺彩超外，还应嘱患者行乳腺彩超、妇科彩超检查。同时，应提高患者对肿瘤、糖尿病、动脉硬化、酒精性脂肪肝的预防意识。目前，西医治疗这3种疾病虽有一定效果，但有诸多不良反应，而中医药可通过多靶点、多途径治疗此类疾病，异病同治，安全可靠。随着现代信息技术的发展，疾病间的分子关联网络将逐步揭示。生物信息技术也必将成为阐释中医药理论的利器，为中医药基础研究及临床组方提供新思路与新方法。