银杏叶提取物对小鼠气管平滑肌舒张作用研究

高 云，廖 灿，于孟飞*，黄 露

(1.中南民族大学 生命科学学院，湖北 武汉 430074；2.华中科技大学同济医学院附属梨园医院 药剂科，湖北 武汉 430077)

目前，医学界主要以β2受体激动剂与糖皮质激素联合使用来缓解哮喘症状[1-2]，但应用中草药等补充和替代药物治疗哮喘依然广泛。银杏叶提取物(EGB)中含有银杏黄酮、银杏内酯、多糖、蒽醌等化合物，其主要成分为24%的黄酮苷和6%的内酯。研究证实，银杏叶提取物具有抗氧化、扩张血管、降血压、辅助降血脂等功效，并可降低气道重塑重要调节因子MMP-9的表达[3-5]。因此，银杏叶提取物具备成为一种新型支气管扩张剂的潜力。本研究旨在探究银杏叶提取物对于预收缩的气管平滑肌的舒张作用，研究引起其舒张的作用机制，以期为银杏叶药物开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级雄性小鼠，平均年龄6～8周，体质量(22.1±2.2)g，购自湖北省疾病预防控制中心(合格证号：42000600036099)。雄鼠饲养于室温约25 ℃、湿度约50%和12 h光暗循环中的适宜条件。该实验已获得中南民族大学实验动物伦理道德委员会批准(许可证号：2019YMF06)。实验动物从业人员上岗证号：TY2018716。雄性小鼠每次实验重复6次，以正常小鼠初始张力为对照。

1.2 试剂

银杏叶提取物粉末(西安天一生物技术公司提供)；吡唑3(批号：083113)、硝苯地平(批号：MKCB9232)、乙酰胆碱(批号：BCBV3168)均购自美国Sigma公司。

1.3 仪器

JH-2型张力换能器(购自中国北京航天医学工程研究所)；生物机能实验系统(BL-420S)，HV-4型离体组织器官恒温灌流系统和超级恒温水浴(HW-1000)(均购自成都泰盟科技有限公司)。

1.4 实验药物制备

精密称取700 mg的银杏叶提取物粉末，加入2 mL DMSO混匀，得到浓度为350 g·L-1的银杏叶药液，调节pH值至7.4。Nifedipine用DMSO溶解，配成母液浓度为10 μmol/L；Pyr3用DMSO溶解，配成母液浓度为30 μmol/L；Ach用高钙溶液溶解，配成母液浓度为100 μmol/L。

1.5 方法

1.5.1 实验预处理 调节HV-4离体组织器官恒温灌流系统至37 ℃，调节通氧量适量，向每个浴槽中加入6 mL的高钙溶液，最后设置生物机能实验系统(BL-420S)的参数。

1.5.2 气管制备 剪取处死后昆明鼠长度约为5 mm左右的气管环，将气管环通过挂钩挂在张力换能系统上，置于含有6 mL高钙液并持续通氧的37 ℃恒温水浴槽内。调节张力为300 mg进行平衡，每15 min换液1次，共换4次高钙液，平衡1 h后开始正式实验。

1.5.3 银杏叶提取物浓度梯度对Ach预收缩的舒张作用实验 气管环经过高钙液平衡4次后，加入6 μL 100 μmol/L的Ach，等待气管环收缩达最大值且稳定后，依次加入适当体积的350 g·L-1的银杏叶药液，使其浓度梯度依次为10-2，10-1.5，10-1，10-0.5，100，100.5，100.75，101g·L-1，加入的银杏叶药液体积分别为0.17 μL、0.37 μL、1.16 μL、3.72 μL、11.8 μL、37.5 μL、43.3 μL、78.4 μL，每个浓度进行12 min的实验，并观察不同浓度所能引起的最大舒张值。每个浓度在6个气管环上重复。

1.5.4 银杏叶提取物对预收缩后Nifedipine阻断后的舒张作用实验 气管环经过高钙液平衡1 h后，向灌流槽中加入6 μL 100 μmol/L的Ach，待气管环达到平台期后，向恒温通氧的水浴槽中加入6 μL 10 μmol/L的L型钙离子通道抑制剂Nifedipine，待其舒张达到最大值且稳定后，加入浓度350 g·L-1的银杏叶药液43.3 μL，观察肌张力曲线变化。该实验在6个气管环上重复。

1.5.5 银杏叶提取物对预收缩后Pyr3阻断后的舒张作用实验 气管环经高钙液平衡1 h后，向灌流槽中加入6 μL 100 μmol/L的Ach，待气管环达到平台期后，向恒温通氧的水浴槽中加入6 μL 30 μmol/L的非选择性阳离子通道抑制剂Pyr3，待其舒张达到最大值且稳定后，加入浓度350 g·L-1的银杏叶药液43.3 μL，观察肌张力曲线变化，该实验在6个气管环上重复。

1.5.6 银杏叶提取物对高K+诱导的预收缩舒张作用实验 气管环经过平衡和预刺激操作后，向灌流槽中加入120 μL高钾溶液，刺激气管环并使小鼠气管收缩达到最佳状态，等待肌张力曲线进入平台期，记录肌张力曲线显示数值。然后加入浓度350 g·L-1的银杏叶药液98 μL，观察肌张力曲线变化情况。该实验在6个气管环上重复。

2 结果

2.1 银杏叶提取物对Ach诱导的预收缩舒张作用

实验结果显示，银杏叶提取物(EGB)能够诱导Ach预收缩的气管环舒张，且这种舒张呈现浓度依赖性，当银杏叶提取物浓度达到5.62 mg/mL时，舒张作用达到最大。将引起气管环最大收缩的最低浓度5.62 mg/mL作为本次实验的最佳药物浓度。图1A为不同浓度银杏叶提取物对Ach预收缩的气管环舒张作用，图1B为不同浓度银杏叶提取物对Ach预收缩的气管环舒张的剂量曲线。

图1 银杏叶提取物对Ach预收缩的气管环的舒张作用

2.2 Nifedipine对银杏叶提取物舒张气管平滑肌的影响

实验结果显示，10 μmol/L的Nifedipine能够部分阻断Ach诱导的收缩，5.62 mg/mL的银杏叶提取物又部分阻断了Ach诱导的收缩。Nifedipine是一种L型钙离子通道特异性阻断剂，具有抑制钙离子内流的作用，能松弛血管平滑肌。Ach同时激活非选择性阳离子通道和L型钙离子通道，从而导致钙离子内流和胞质内钙离子增加进而触发气管平滑肌收缩。这些结果表明，银杏叶提取物可能通过抑制L型钙离子通道和非L型钙离子通道来参与Ach诱导的气管平滑肌的舒张，随后验证银杏叶提取物是否可能通过抑制非选择性的阳离子通道来参与Ach诱导的气管平滑肌舒张。图2表示银杏叶提取物在Nifedipine存在的条件下对Ach预收缩的气管环的舒张作用。

注:与Ach组比较，*P<0.05；与ACH+Nifedipine组相比较，

2.3 Pyr3对银杏叶提取物舒张气管平滑肌的影响

实验结果显示，30 μmol/L的Pyr3能够部分地阻断Ach诱导的收缩，5.62 mg/mL的银杏叶提取物又部分地阻断了Ach诱导的收缩。Pyr3是阳离子通道TRPC3和Orai1的非选择性抑制剂，能够部分抑制Ach诱导的收缩。这些结果表明，非选择性阳离子通道可能参与了银杏叶提取物诱导的气管环舒张。图3表示银杏叶提取物在Pyr3存在的条件下对Ach预收缩的气管环的舒张作用。

注：与Ach组比较，*P<0.05；与ACH+Pyr3组相比较，#P<0.05。

2.4 银杏叶提取物对高K+诱导的预收缩的舒张作用

实验结果显示，浓度为5.62 mg/mL的银杏叶提取物能完全舒张高钾诱导的收缩。高钾离子溶液通过去极化激活L型钙离子通道，进而引起气管平滑肌收缩。这些结果表明，银杏叶提取物可通过抑制高钾溶液激活的L型钙离子通道舒张气管平滑肌。图4为银杏叶提取物对高钾预收缩的舒张作用。

注：与K+组比较，*P<0.05。

3 讨论

银杏叶提取物是一种前景较好的可用于治疗气道炎症的生物资源[6-8]。据研究报道，银杏叶提取物中含有丰富的黄酮，而黄酮是一类具有极佳抗炎效果的物质。此外，在银杏叶提取物中存在一类特有的萜类物质银杏内酯，被公认是一种天然的PAF拮抗剂，而PAF在气道炎症中至关重要，可导致肺气道炎症加重[9-12]。银杏叶提取物对气管平滑肌是否具有舒张作用，其相应的作用机理如何，值得进行深入研究。

为了解银杏叶提取物舒张气管平滑肌的机制，本实验研究了L型钙离子通道阻断剂对于银杏叶提取物舒张气管的影响。实验结果表明，L型钙离子通道阻断剂Nifedipine可部分舒张已收缩的气管，而银杏叶提取物可持续引起气管舒张，但舒张作用较对照情况下(图2)显著变小。这表明银杏叶提取物可通过阻断L型钙离子通道来实现对气管平滑肌的舒张作用。本实验还研究非选择性的阳离子阻断剂对于银杏叶提取物舒张气管的影响。实验结果表明，非选择性的阳离子阻断剂Pyr3可部分舒张已收缩的气管，而银杏叶提取物可持续有效舒张气管平滑肌，但舒张作用较对照情况下(图3)显著变小。这表明银杏叶提取物可通过阻断钙敏感通路实现对气管平滑肌的舒张作用。为深入研究银杏叶舒张气管平滑肌的机制，本实验探讨了银杏叶提取物对于高K+收缩的气管平滑肌的舒张作用。由图4可见，银杏叶可强烈舒张高K+引起的气管平滑肌收缩。这可能是因为银杏叶可通过阻断L型钙离子通道，从而发挥舒张气管平滑肌的作用。

银杏叶对于气管平滑肌具有强烈的舒张作用，其舒张作用主要通过L型钙离子通道和钙敏感通道发挥作用。因此，将银杏叶开发为治疗慢性支气管炎、哮喘等呼吸系统疾病的药物具备潜在可能性。