不同纯度枸杞多糖对光诱导人RPE细胞氧化应激损伤保护作用研究

李 娟，师若迪，高园园，黄 洁，俞 洋，4*

(1.宁夏医科大学 中医学院，宁夏 银川750004：2.陕西榆林市眼科医院，陕西 榆林 719000；3.宁夏医科大学 外国语教学部，宁夏 银川 750004；4.宁夏少数民族医药现代化教育部重点实验室，宁夏 银川750004)

老年性黄斑变性(Agerelated macular degeneration，AMD)为黄斑区一种慢性退行性疾病，是导致中老年人低视力和失明的关键性因素[1]。AMD临床特征可分为干性和湿性两型，其中约90%的AMD视力损害均与湿性AMD有关，主要症状为脉络膜新生血管形成及黄斑部出血、水肿，继而导致瘢痕组织生成，破坏中心部视网膜[2]。研究表明，AMD发病因素受年龄、眼压、炎症反应及氧化应激等因素的影响，其中，氧化应激是AMD形成和发展的重要因素[3]，因而备受重视。实验证明，枸杞子对光诱导人视网膜色素上皮(Retinal pigment epithelium，RPE)细胞具有一定保护作用[4]。枸杞子是一种名贵药材和滋补品，它含有丰富的枸杞多糖、维生素、微量元素等化学物质，枸杞子的主要有效成分枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharides，LBP)，具有抗氧化和抗衰老等特性。研究表明，枸杞多糖可减轻氧化应激对人视网膜色素上皮细胞的损伤，由于提取工艺的影响，成品枸杞多糖的纯度各不相同。因此，本研究旨在探讨该差异对人视网膜氧化损伤保护作用的影响，本实验选取纯度为50%、65%的LBP，以人RPE为研究对象，分析检测细胞内活性氧自由基(ROS)、细胞超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的含量，探讨不同纯度枸杞多糖对氧化损伤RPE细胞的保护作用，以期有效开发枸杞多糖的药用价值。

1 材料与仪器

1.1 细胞株

原代人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)，购自北纳生物。

1.2 主要试剂与药物

50%、65%纯度LBP、青霉素-链霉素混合液、胰蛋白酶(索莱宝生物科技有限公司)；磷酸盐缓冲液、DMEM/F12(HyClone)；活性氧(ROS)检测试剂盒(凯基生物技术股份有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)(南京建成生物科技有限公司)；丙二醛(MDA)(伊莱瑞特生物科技有限公司)；胎牛血清(Gibco)。

1.3 主要仪器

CO2培养箱、Multiskan 酶标仪(购于Thermo公司)；FACSAriaⅡ型流式细胞检测仪(购于美国BD公司)；TES-1332A 数位式照度计(购于台北泰仕电子工业股份有限公司)。

2 方法

2.1 LBP溶液配制

将分别称量好的(50%、65%)5 mg LBP粉末，溶解于新鲜配置的5 mL完全培养基中，配制浓度为1 mg/mL LBP原液，配制好的原液用过滤器灭菌过滤，将其稀释10倍制成终浓度为0.1 mg/mL LBP溶液。

2.2 细胞培养

将ARPE-19用含10%FBS、1%双抗的完全培养基于37 ℃的培养箱中培养，细胞隔2天换液1次，以1∶4比例传代培养，选取2～5代细胞用于实验。

2.3 构建人RPE 细胞光损伤模型

选取2～4代ARPE-19 细胞于6孔板中培养，用光照强度为(16 500±200) lux的LED冷光灯垂直照射细胞24 h，培养箱内温度为37.5 ℃，其中正常组用锡纸包裹。

2.4 实验分组

hRPE细胞组(对照组)、hRPE细胞+光照射组(模型组)、hRPE细胞+光照+50%枸杞多糖组、hRPE细胞+光照+65%枸杞多糖组，于光照24 h给予指标检测。

2.5 CCK8法检测细胞存活率

ARPE-19细胞以(5×103个/孔)接种于96孔板，对细胞进行干预处理后，参照试剂盒要求进行步骤操作，酶标仪检测在450 nm波长处各孔的OD值。

2.6 细胞活性氧自由基(ROS)含量检测

光照结束后收集各处理组细胞，将细胞悬浮于稀释好的CM-H2DCFDA 中，避光孵育 30 min，无血清培养基洗细胞3次后用滤网过滤，流式细胞仪FITC通路检测ROS含量。

2.7 细胞SOD活力及MDA含量检测

各组细胞于光照处理后，按SOD、MDA试剂盒说明书进行检测。

2.8 统计学分析

3 结果

3.1 枸杞多糖对光诱导ARPE-19 细胞存活率的影响

与正常组比较，模型组细胞存活率显著降低(P<0.01)；与模型组比较，枸杞多糖(50%、65%)干预组细胞存活率显著升高(P<0.01)；与50%枸杞多糖组比较，65%枸杞多糖组细胞存活率显著升高(P<0.01)。见表1。

表1 枸杞多糖对光诱导 ARPE-19细胞存活率的影响>

3.2 枸杞多糖对光诱导ARPE-19 细胞活性氧水平的影响

与正常组比较，模型组细胞ROS水平显著升高(P<0.01)；与模型组比较，枸杞多糖(50%、65%)干预组细胞ROS水平显著降低(P<0.01)；与50%枸杞多糖组比较，65%枸杞多糖组细胞降低ROS水平更显著(P<0.01)。这表明枸杞多糖能抑制光诱导的hRPE细胞活性氧水平。见表2。

表2 枸杞多糖对光诱导的ARPE-19细胞活性氧水平的影响

3.3 枸杞多糖对光诱导的 hRPE 细胞总 SOD 活性及 MDA 含量的影响

与正常组比较，模型组细胞中MDA含量明显增多(P<0.01)；与模型组比较，枸杞多糖(50%、65%)干预组细胞中MDA含量明显降低(P<0.01)；与50%枸杞多糖组比较，65%枸杞多糖组细胞中MDA含量降低(P<0.01)。这表明光照可以诱导hRPE细胞MDA含量增多，且枸杞多糖可降低光损伤后hRPE细胞中MDA含量。此外，与正常组比较，模型组细胞中SOD活力显著下降(P<0.01)；与模型组比较，枸杞多糖(50%、65%)干预组细胞中SOD活力明显上升(P<0.01)；与50%枸杞多糖组比较，65%枸杞多糖组细胞中SOD活力升高(P<0.01)。这表明光照可以诱导hRPE细胞SOD活力下降，且枸杞多糖可增加光损伤后hRPE细胞中SOD活力。见表3。

表3 枸杞多糖对光诱导ARPE-19细胞SOD活性及MDA含量的影响

4 讨论

AMD是一种由视网膜色素上皮细胞及神经视网膜退行性病变引起的视力下降疾病，由于视觉的高分辨率及色觉辨别在很大程度上依赖于黄斑，因而AMD可导致严重的视力损伤甚至永久性失明[5]。AMD是一种多因素致盲性疾病，发病率高，为致盲的首要病种。因此，AMD病因病机研究是眼科学关注的焦点之一。其病理改变主要为氧化应激、炎症、衰老、高血压等因素引起RPE细胞损伤，继而导致玻璃膜疣和地图样萎缩，以及脉络膜毛细血管阻滞[6]。有关研究表明，氧化应激与AMD的发生发展密切相关[7]。氧化应激是当机体遭受有害刺激时，体内ROS含量随之增加，其氧化程度超出氧化物的清除能力，氧化与抗氧化作用间失去平衡，从而导致细胞损伤[8]。生理含量的ROS对于维持正常生命活动至关重要，在氧化应激状态下，ROS大量释放，当过量生成的ROS超过机体内源性抗氧化防御能力时，则造成细胞氧化损伤，从而导致视功能损害[9]。MDA是最重要的膜脂过氧化产物之一，其含量可反映组织自由基的水平和脂质过氧化程度[10]。SOD作为体内氧自由基清除剂，能保护机体免受氧化损伤，具有抗氧化和延缓衰老的特性[11]。中医学认为，该病的发生与肝肾阴虚、精血亏虚有关。目前，中医药治疗AMD取得了一定临床疗效。研究表明，枸杞子防治眼病疗效显著，为防治AMD的首选药[12]。枸杞子性平，味甘质润，入肝经、肾经、肺经，中医认为它有补肾益精、养肝明目、益气等功效。枸杞多糖是枸杞子主要生物活性成分，大量研究表明，枸杞多糖具有免疫调节、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤等多种功能，这与其具有Glycan-O-Ser结构的糖缀合物——枸杞糖肽(LbGP)密切相关[13]，枸杞糖肽(LbGP)是从枸杞多糖中分离纯化得到的一种有免疫活性的糖蛋白，具有较强的细胞免疫功能及抗氧化作用[14]。研究证明，LBP有减弱炎症反应和抑制氧化应激反应的作用[15]，如LBP可减轻H2O2诱导人晶状体上皮细胞的氧化应激损伤，具有保护作用且能抑制细胞凋亡[16]；枸杞多糖可抑制糖尿病小鼠视网膜内的血管新生，减轻氧化应激反应和炎症反应，对糖尿病视网膜病变疗效确切[17]；枸杞多糖通过增强抗氧化应激作用来保护海马神经元细胞，从而提升癫痫大鼠的学习记忆能力[18]；LBP可有效减弱帕金森病小鼠中脑氧化应激损伤，保护黑质致密部多巴胺能神经元[19]。目前，枸杞多糖的提取、分离、纯化、改性以及结构鉴定等方面的研究取得了长足进步，随着枸杞多糖提取技术的发展，枸杞子的资源化利用将会愈加广泛。

本研究结果显示：光照可显著降低ARPE-19 细胞存活率，而枸杞多糖干预后细胞的活力明显上升。LBP可通过其抗氧化功能保护光诱导损伤的ARPE-19细胞，可显著降低光诱导ARPE-19细胞损伤后的ROS水平及MDA 含量，而细胞中SOD活力呈明显上升趋势。这表明枸杞多糖能抑制hRPE细胞的氧化应激反应，提高细胞对抗光损伤的能力。在提升LBP的纯度后，其抗氧化能力逐渐增强，进一步增强了其保护作用。

本研究发现，采用提升枸杞多糖纯度的方法有助于减轻细胞氧化损伤，增强保护作用，由于本实验条件有限，未能选用更高纯度的枸杞多糖，因此对其保护作用的差异性还有待进一步研究和验证。