两种免疫检测法在HIV 抗体检测中的效果对比分析

刘世豫，田居灵，梁 静（通信作者）,宋晨辉

（1 新疆医科大学第六附属医院输血科 新疆 乌鲁木齐 830002）

（2 乌鲁木齐市第一人民医院检验科 新疆 乌鲁木齐 830011）

（3 新疆医科大学第六临床医学院 新疆 乌鲁木齐 830011）

获得性免疫缺陷综合征（acquired immune deficiency syndrome, AIDS）是由人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus, HIV）感染引起，可通过攻击患者免疫系统，将淋巴细胞大量吞噬，并破坏其合成，最终导致免疫系统崩溃。目前，AIDS 在人群中的传染性极强，病死率较高，暂无有效的预防与治疗手段，对患者的生命带来巨大威胁。因此，HIV 的早期诊断就显得极为重要，尽早发现感染者、切断传播途径对抑制AIDS 的传播具有积极的意义。但HIV 的检测具有一定的特殊性，任何漏检或误检均可对被检者与社会造成重大的影响，因此，临床筛查HIV 的方法需具有较高的敏感性与特异性。酶联免疫吸附试验法（enzymelinked immunosorbent assay, ELISA）因其简便、敏感、易于标准化等优点，被广泛运用于HIV 筛查中。但ELISA 检测方法存在着操作复杂、检测周期长等缺点，可一定程度上影响检测结果。电化学发光免疫分析法（electrochemiluminescence immunoassay, ECLIA）较ELISA 法较为快捷，且检测的敏感性也较高，在HIV 筛查中具有一定的优势。但临床研究发现，ELISA 与ECLIA法检测阴性也不能完全排除HIV 感染的风险。因此关于两种检测方式的具体价值目前尚无定论。基于此，本文旨在探讨ELISA 法与ECLIA 法用于HIV 抗体检测中的效果，现报道如下。

1.资料与方法

1.1 一般资料

选取2017 年7 月—2021 年7 月新疆医科大学第六附属医院进行HIV 抗体检测的10 316 份血液样本。

纳入标准：①受检者存在艾滋病高危因素（如娱乐场所从业人员、男男同性恋、伴侣较多、与HIV 携带者性接触等），疑似HIV 感染；②受检者意识清晰，认知功能良好；③受检者既往未接受过相关的治疗。排除标准：①受检者患有恶性肿瘤；②受检者存在严重感染；③心、肝、肾等脏器功能不全者；④无效血液标本或存在血液性疾病。受检者中男5 977 例，女4 339 例；年龄18 ～65 岁，平均年龄（31.56±4.42）岁。

1.2 方法

仪器与试剂：ELISA 采用EL10A 型酶标仪（济南鑫贝西生物科技有限公司）及武汉伊艾博科技有限公司试剂；ECLIA 采用CIA 型全自动电化学发光免疫分析仪及配套试剂（济南欧莱波技术有限公司）。ELISA：（1）取受检者清晨空腹外周肘静脉血液6 mL，分别装于2 个不同的试管内，低温保存待检。（2）将1 支待检血液，采用离心机（重庆三大伟业制药有限公司），以3 000 r/min 速率离心10 min，取血清。（3）将酶标板取出，设置为1孔样品、1 孔空白对照、2 孔阴性对照、3 孔阳性对照模式，并对其进行标记；将对应阳性、阴性对照品及样品各100 μL 分别加入出空白孔外的其他每孔中。（4）置于37 ℃恒温箱中经30 min 孵育，孵育结束后，用洗板机洗板6 次，洗板洗涤液用量为400 μL 每孔每次，加洗涤液后需静置10 s，洗板结束后，拍干残余洗液。（5）每孔加入酶标记抗原100 μL（空白孔除外），轻轻振荡，盖好封板膜，置于37 ℃恒温箱中再次进行30 min 孵育、6 次洗板及拍干后，加入底物液，进行15 min 避光反应后加终止液使反应终止。（6）应用酶标仪读取各孔吸光度（Absorbance, OD）值，cut-off 值=阴性对照OD均值+0.1，样品OD 值＞cut-off 值为阳性。操作过程严格按照试剂盒操作说明书进行，将检测结果为阳性样本送HIV 确认中心确认。ECLIA：（1）取另1 支待检测样品，采用离心机（重庆三大伟业制药有限公司），以800 r/min 速率离心处理5 min，将样品与生物素抗HIV-1p24 单克隆抗体孵育成抗原-抗体复合物。（2）将磁微粒应用磁石收集好，将其中未反应物质除去，而后加抗HIV 抗原（经碱性磷酸酶标记）与磁微粒的HIV 抗体反应。（3）再次将磁微粒应用磁石收集好，将其中未反应物质除去，再加入发光底物后充分搅拌，使磁微粒分散，随后添加清洗剂。检测复合物发光强度，计算cut-off 值。结果确认：将检测结果为阳性样本送HIV 确认中心确认（主要采用方法为蛋白印迹法）。

1.3 观察指标

（1）检测阳性率：统计并比较两种检测方法检测阳性标本数量。（2）初筛结果比较：观察两种方法检测HIV 抗体浓度分布情况及与检测结果符合率。

1.4 统计学方法

2.结果

2.1 两种HIV 抗体检测方法阳性率、假阳性率比较

10 316 份检测样本中，ELISA 检测出阳性样本30 份，阳性率为0.29%（30/10 316）；ECLIA 检测出阳性样本28 份，阳性率为0.27%（28/10 316），ELISA 与ECLIA检测阳性率比较，差异无统计学意义（＞0.05）；最终经确认中心确认阳性样本26 份。ELISA 法假阳性率15.38%（4/26）；ECLIA 法假阳性率7.69%（2/26）。两种检测方法假阳性率比较，无显著差异（＞0.05）。见表1。

表1 两种HIV 抗体检测方法阳性率比较[n（%）]

2.2 两种检测方法初筛结果与确认结果比较

ELISA 法检测出阳性样本的吸光度值/临界值（OD/CO）多分布于1.35 ～1.80 范围内，确诊符合率均值为83.61%；ECLIA 检测出阳性样本的临界值（cutoff）多在150.00 ～220.00 范围内，确诊符合率均值为89.58%。但两种方法确诊符合率均值比较，差异无统计学意义（= 1.535，= 0.215），见表2、表3。

表2 ELISA 测定结果与确认结果比较

表3 ECLIA 测定结果与确认结果比较

3.讨论

HIV 病毒属于RNA 病毒逆转录病毒克慢性毒属，HIV感染者到疾病进展至“全面暴发”的AIDS 前有一个较长的潜伏期，因此无症状HIV 感染不易被发现，临床干预较为困难，患者的病死率较高。因此，检测HIV 感染、监测病毒在患者体内的复制情况、了解感染后病情的发展等对于病毒传播的控制及用药的指导等具有十分重大的意义。

目前，检测HIV 抗体的常用方法包括ELISA 法及ECLIA 法。（1）ELISA 法是在不改变抗体的免疫学特性的情况下，酶分子与抗体或抗原的蛋白分子共价结合（该种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性），通过底物溶液的滴加，在酶的作用下使底物所含的供氢体发生还原反应，呈现出颜色的变化，以此来判断是否发生免疫反应，具有一定检测价值。（2）ECLIA 法将高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，具有较高的灵敏度、特异度，被广泛用于各种抗体、抗原、激素、酶等的监测与分析中。且ECLIA 法具有线性范围宽、线性拟合度好、操作快速简便、不存在环境污染等优点，能够提高HIV 抗体检测的准确性，已逐步成为检测的主流技术。但具体何种检测方法价值更高还需探究。

本文结果显示，通过ELISA 法与ECLIA 法检测HIV抗体，样本呈现阳性率的差异无统计学意义。提示两种检测方式用于HIV 抗体检测均可达到一定的符合率。分析原因可能为，（1）ELISA 法检测的敏感性虽然较高，但该种方法需要游离抗原、抗体及结合状态的抗原、抗体，因此需要反复加样及洗板，操作相对复杂，且用于检测的包被孔之间有时会因为交叉污染而出现假阳性，导致检测结果可能存在一定误差。（2）ECLIA 将抗体（抗原）用法学发光剂直接标记，与待检测样本中相应的抗原（抗体）和磁颗粒性抗体（抗原）发生免疫反应后，以磁场的方式分离出不同状态下的化学发光标记物，此时加入氧化剂和氢氧化钠呈现碱性环境，吖啶酯即可在无催化剂的情况下分级、发光。但是，从HIV 感染到血清转阳前的一段时期内，通常会遇到检测不出HIV 特异性抗体的窗口期，其时间长短因病毒的致病性和宿主的免疫应答不同而异。因此，检测HIV 的方法仍需继续探讨。

OD/CO 值cut-off 值越高，确认符合率越高。本文结果还显示，ELISA 法检测出阳性样本的吸光度值/临界值（OD/CO）多分布于1.35 ～1.80 范围内，确诊符合率均值为83.61%；ECLIA 检测出阳性样本的临界值（cut-off）多在150.00 ～220.00 范围内，确诊符合率均值为89.58%。但两种方法确诊符合率均值比较，差异无统计学意义（= 1.535，= 0.215）。提示两种检测方式均对高浓度下HIV 抗体准确率更高。这可能是因为高浓度下，检测试剂的反应性更为强烈，因此检测准确度也相较提升。杨若男等收集郑州大学第一附属医院646 例患者筛查HIV 情况发现，ECLIA 诊断HIV 抗体的ROC 曲线下面积为0.990，cutoff 值32.17,灵敏度97.10%，特异度96.20%，CLIA 检测值COI 越大，蛋白印迹法的阳性率越高。该结果可为采用酶联免疫试验检测HIV 抗体的检测策略提供重要的参考依据。本文结果与其一致，但在每次检测中并不能排除无低浓度样本的存在，因此两种检测方式呈现的阳性样本需要送确认中心进行再次确认。林琳等研究建议，实验室应该用两种方法同时进行HIV 抗体检测，以此排除不同试剂灵敏性差异的缺陷。因而，临床HIV 抗体检测时可考虑ELISA法与ECLIA 法联合检测，对提高检测阳性率可能具有一定的意义。

综上所述，ELISA 法与ECLIA 法用于HIV 抗体检测中效果显著，符合率较高，但两种方法各有优劣势。无论是ELISA 法还是ECLIA 法检测HIV 抗体，在结果报告时仍需参照患者的临床进行相应的综合分析，对检测是否为阳性做出客观的判断，为明确是否随访、进一步确定实验结果等提供重要的参考依据。因时间限制，未对试验的条件进行优化和全面的评价，下一步拟优化反应条件，减少外界因素对检测结果的影响。