阿司匹林对口腔鳞癌细胞增殖与凋亡影响及机制

丛蓓蓓,徐颖婕,高美华,于习习,王万春,王芳

(青岛市口腔医院,山东 青岛 266001 1 中心实验室； 2 口腔黏膜科； 3 药剂科)

口腔鳞状细胞癌(OSCC)目前是全球第六大常见恶性肿瘤，在癌症相关死亡率中排名第八[1]。OSCC的发生与发展是一个复杂的过程，包括大量遗传和表观遗传癌基因的积累和抑制基因的丢失，导致多种信号通路失调，从而破坏细胞增殖和细胞凋亡之间的平衡[2]。即使采取了外科手术结合放疗和(或)化疗的治疗方式，OSCC病人的5年生存率也仍保持在50%～60%[3]。虽然临床和实验室研究表明，OSCC细胞已经对临床化疗药物产生了耐药性[4]，但是，上皮细胞的恶性转变需要经历很长的时间，包括多种细胞和基因的改变，故药物干预是癌症转化之前的最佳手段。阿司匹林是一种众所周知的非甾体抗炎药，常用于预防反复发作的短暂性脑缺血或卒中[5]。除了其经典的抗炎功能之外，临床和流行病学研究表明，阿司匹林可用于多种癌症的预防或治疗[6-8]。研究揭示阿司匹林在结直肠癌的化疗预防中起重要的作用[9-12]，但仍需对其他的癌症，包括口腔癌，进行多项低剂量阿司匹林治疗的试验，从而明确其具体的作用机制及最佳化学预防剂量。本研究探讨不同浓度的阿司匹林对口腔鳞癌细胞SCC-9生长的影响，并检测SCC-9细胞凋亡、细胞增殖等指标。旨在为阿司匹林辅助治疗OSCC提供实验依据，增加对口腔鳞癌发病机制的了解。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人鳞癌细胞系SCC-9购自浙江美森细胞科技有限公司。胎牛血清购于依科赛生物科技有限公司(上海，中国)。DMEM培养液购于Hyclone公司(犹他州洛根，美国)。阿司匹林原料药、青霉素、链霉素、胰蛋白酶、甲基噻唑基四唑(MTT)细胞增殖和毒性测定试剂盒、β-actin一抗和HRP标记的二抗均购自索莱宝生物有限公司(北京，中国)。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)试剂盒和Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒购于碧云天生物有限公司(上海，中国)。Trizol试剂、反转录试剂盒、荧光定量试剂盒购自艾科瑞生物工程有限公司(长沙，中国)。抗人Bcl-2一抗、Bax一抗均购自圣克鲁斯生物技术公司(得克萨斯州达拉斯，美国)。ECL发光试剂购自赛默飞世尔科技公司(马萨诸塞州沃尔瑟姆，美国)。

1.2 实验方法

1.2.1细胞培养及分组 SCC-9细胞使用含体积分数0.10胎牛血清及体积分数0.01青霉素-链霉素的DMEM培养液培养。细胞置于37 ℃、体积分数0.05 CO2的恒温培养箱中，用2.5 g/L的胰蛋白酶(含EDTA)消化细胞，每2～3 d传代或更换细胞培养液1次。取对数期生长的SCC-9细胞培养过夜，分为A、B、C、D、E、F组，分别加入含不同浓度(0、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 mmol/L)阿司匹林的培养液，用于后续实验。

1.2.2MTT法检测细胞增殖 取对数期生长的SCC-9细胞接种于96孔细胞培养板，每孔5×103个细胞(体系100 μL)。按照1.2.1方法分组处理，每组设置5个复孔，培养24 h后检测细胞增殖变化。弃去含药培养液，加入90 μL新鲜培养液及10 μL的MTT后继续培养4 h；弃去培养液，每孔再加入110 μL的Formazan溶液，在全自动酶标仪上振荡约10 min，测定490 nm波长处吸光度值。

1.2.3平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力取对数期生长的SCC-9细胞接种于6孔细胞培养板，每孔1×103个细胞(体系1 mL)。按照1.2.1方法分组处理，培养48 h后，弃去含药培养液，更换为正常DMEM培养液。置于37 ℃、含体积分数0.05 CO2的恒温培养箱继续培养3周左右。期间观察、换液，当6孔板内出现肉眼可见克隆时，终止培养。弃上清，PBS工作液浸洗2次，加入40 g/L多聚甲醛溶液固定15 min。去除固定液，加入1 g/L结晶紫室温染色5 min，流水清洗染色液，干燥，拍照。通过Image J图像分析软件计算克隆数。

1.2.4流式细胞术检测细胞凋亡 取对数期生长的SCC-9细胞接种于12孔细胞培养板，每孔1×105个细胞(体系1 mL)。按照1.2.1方法分组处理，培养24 h后，用胰蛋白酶消化细胞，PBS清洗2次。用195 μL的Annexin V-FITC结合液重悬细胞，加入5 μL的Annexin V-FITC和10 μL碘化丙啶染色液避光孵育20 min。使用DxFLEX流式细胞仪进行凋亡率检测，并分析结果。

1.2.5实时荧光定量PCR方法检测Bcl-2和BaxmRNA表达 取对数期生长的SCC-9细胞接种于6孔细胞培养板，每孔1×105个细胞。按照1.2.1方法分组处理培养24 h后，加入Trizol试剂提取总RNA，根据反转录试剂盒的说明将总RNA反转录成cDNA。反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火、延伸30 s，共40个循环。实验共重复5次。由PCR反应曲线得到域值循环数(Ct)，以GAPDH作为内参照，采用一步法实时荧光定量PCR分析SCC-9细胞中Bcl-2、Bax基因的表达水平。所用引物及其序列见表1。

表1 PCR引物及其序列

1.2.6Western blot法检测Bcl-2和Bax蛋白的表达 取对数期生长的SCC-9细胞接种于6孔细胞培养板，每孔1×105个细胞。按照1.2.1方法分组处理培养24 h后提取总蛋白，使用BCA蛋白质测定试剂盒测量蛋白质浓度，置于120 g/L的SDS-PAGE凝胶上电泳，电转至PVDF膜上，膜在室温下用50 g/L脱脂牛奶封闭2 h，并在4 ℃下与一抗孵育过夜。TBST冲洗3次后加入HRP标记的二抗室温振荡孵育2 h，TBST冲洗，使用ECL试剂和Fluor Chem Q凝胶成像分析系统对印迹的膜进行曝光和分析。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 不同浓度阿司匹林对SCC-9细胞生长影响

与对照组相比较，经低浓度阿司匹林(1.25、2.50 mmol/L)处理的SCC-9细胞生长状态良好，细胞呈多边形或是长梭形，细胞边缘饱满，偶可见皱缩细胞；5.00 mmol/L阿司匹林处理组与对照组相比，细胞仍可保持原有的形态，但饱满程度较差，皱缩细胞增多；高浓度阿司匹林(10.00、20.00 mmol/L)处理后，细胞形态发生显著变化，细胞皱缩变形，细胞间隙明显变宽。见图1。

A、B、C、D、E、F组的阿司匹林浓度分别为0、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 mmol/L。

2.2 不同浓度阿司匹林对SCC-9细胞增殖活力的影响

MTT实验结果显示，与对照组相比较，1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 mmol/L阿司匹林对SCC-9细胞增殖抑制作用越来越显著。阿司匹林浓度达到5.00 mmol/L时，SCC-9增殖受到抑制，与对照组相比差异有统计学意义(F=30.31，P<0.05)；高浓度阿司匹林(10.00、20.00 mmol/L)显著影响SCC-9细胞的增殖，与对照组相比差异具有显著性(P<0.001)。见图2。

2.3 不同浓度阿司匹林对SCC-9细胞克隆能力的影响

平板克隆形成实验显示，接种贴壁细胞成活并形成克隆的数量，直接反映细胞群体的依赖性及增殖能力。与对照组相比，随着阿司匹林浓度的升高，SCC-9细胞克隆数逐渐降低。5.00、10.00 mmol/L阿司匹林处理SCC-9细胞时，克隆形成率下降，差异具有统计学意义(F=59.68，P<0.05)；当阿司匹林达到20.00 mmol/L时显著影响SCC-9细胞的增殖，差异具有显著性(P<0.001)。见图3。

A、B、C、D、E、F组的阿司匹林浓度分别为0、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 mmol/L。与对照组比较,*P<0.05,***P<0.001。

2.4 不同浓度阿司匹林对SCC-9细胞凋亡影响

流式细胞术检测的结果显示，与对照组相比较，不同浓度阿司匹林作用SCC-9细胞后凋亡均有增加，而且与阿司匹林浓度增加程度呈正比。当阿司匹林浓度为2.50、5.00 mmol/L时细胞凋亡数即有所增加，差异有统计学意义(F=816.00，P<0.05)；当阿司匹林的浓度达到10.00、20.00 mmol/L后细胞凋亡数明显增加，差异具有显著性(P<0.001)。见图4。

2.5 不同浓度阿司匹林对SCC-9细胞Bcl-2和Bax基因及其蛋白表达影响

实时荧光定量PCR和Western blot方法检测结果显示，与对照组相比，Bcl-2基因和蛋白表达水平随阿司匹林浓度升高而降低，Bax反之。与对照组相比，当阿司匹林浓度为2.50 mmol/L时Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平有所降低，差异具有统计学意义(F=215.90、9 473.00，P<0.05)；当浓度达到5.00、10.00、20.00 mmol/L时其表达水平明显降低，差异均具有显著意义(P<0.001)；阿司匹林浓度为5.00、10.00、20.00 mmol/L时BaxmRNA和蛋白表达水平与对照组相比明显升高，差异具有统计学意义(F=1 388.00、4 345.00，P<0.001)。见表2和图5。

3 讨 论

口腔颌面部肿瘤是一种常见的恶性肿瘤，伴随着肿瘤多药耐药这一难题的出现，全球口腔癌生存率并没有明显改善，因此开发新型、高效、低毒的抗口腔颌面部肿瘤药物迫在眉睫[2]。阿司匹林(乙酰水杨酸)是最古老的合成药物，作为产生前列腺素和血栓素前体的COX(前列腺素内过氧化物合酶)酶的不可逆抑制剂，逐渐发现了阿司匹林除抗炎药的其他几种应用。阿司匹林作为一种癌症化学预防剂和癌症标志物的主要调节剂，其摄入可用于降低结直肠癌发生的风险[13]，也可以抑制肿瘤细胞本身的生物活性，并干扰支持肿瘤生长的微环境[14]。研究表明，阿司匹林在预防癌症，特别是在结直肠癌方面具有强大的潜力[9,12]。本文以口腔鳞癌SCC-9细胞为研究对象，初步探索阿司匹林对人口腔颌面部恶性肿瘤的抑制作用。

A、B、C、D、E、F组的阿司匹林浓度分别为0、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 mmol/L。与对照组比较,*P<0.05,***P<0.001。

A、B、C、D、E、F组的阿司匹林浓度分别为0、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 mmol/L。与对照组比较，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

表2 不同浓度阿司匹林对SCC-9细胞Bcl-2和Bax mRNA及其蛋白表达影响

A、B、C、D、E、F组的阿司匹林浓度分别为0、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 mmol/L。

本文研究结果显示，在低浓度阿司匹林(1.25、2.50 mmol/L)下SCC-9细胞生长状态良好，细胞饱满；浓度达到5.00 mmol/L后，随浓度上升，细胞形态改变，胞膜皱缩，细胞间隙变宽。MTT及克隆形成实验结果显示，当阿司匹林浓度高于5.00 mmol/L时，明显抑制SCC-9细胞的增殖活力。可见，阿司匹林对SCC-9细胞抑制增殖的作用呈浓度依赖性。大量研究结果表明，阿司匹林可降低结直肠、食管、乳房、肺脏等器官的患癌风险[13-15]，但长期服用阿司匹林可以加重病人胃肠道溃疡及出血的风险。因此，寻找阿司匹林最佳的化学预防剂量至关重要。2.50 mmol/L阿司匹林可抑制乳癌SKBR3细胞的迁移和侵袭能力[16]；5.00 mmol/L阿司匹林即可引起宫颈癌Hela细胞基因组DNA变化[17]。本研究中，阿司匹林达到5.00 mmol/L以上对OSCC细胞出现明显的抑瘤作用。

目前阿司匹林的抗肿瘤机制尚不明确，可能与其通过抑制COX-2酶的活性发挥抑瘤作用有关。在肿瘤发生过程中，COX-2被诱导并进一步增加PGE2的产生，破坏细胞正常的凋亡过程，最终导致肿瘤细胞增殖失调[18]。已有研究表明，阿司匹林可能通过蛋白磷酸酶2A(PP2A)失活减少β-连环蛋白的细胞质池而降低结肠癌病人的发病率[19]；通过抑制NF-κB通路抑制骨肉瘤的生长和转移，并增加骨肉瘤对体外和体内化疗的敏感性；通过调节多种细胞因子的活性和表达，包括半胱天冬酶、Bcl-2、Bax和VEGF等，抑制人骨髓瘤细胞增殖并诱导其凋亡；通过抑制丙酮酸脱氢酶激酶1(PDK1)介导的肿瘤干细胞(CSC)调节机制为侵袭性乳癌提供潜在的治疗机会[20-22]。本研究结果表明，阿司匹林可以促进SCC-9细胞的凋亡，且促进凋亡作用与药物浓度呈正相关。Bcl-2家族蛋白是细胞凋亡与存活的一个重要控制器。本研究结果显示，阿司匹林各浓度组中促凋亡蛋白Bax在转录水平和蛋白水平上显著上升，而抑凋亡蛋白Bcl-2则相反。因此，我们认为阿司匹林可能通过诱导细胞凋亡调控口腔鳞癌细胞SCC-9增殖，并且药物浓度越高其作用越强。

综上所述，该研究主要验证了阿司匹林在口腔鳞癌细胞的抗肿瘤作用，为阿司匹林的抗肿瘤作用提供了一定的基础实验证据。但本研究仍存在不足之处，在口腔鳞癌细胞中阿司匹林通过何种信号通路调控细胞的增殖与凋亡尚缺乏实验证据，因此，后续将进一步探讨其抑制口腔鳞癌细胞的分子调控机制，为口腔鳞癌化学治疗提供新的依据与策略。