MPP+对N2a细胞中CDR1as基因表达的影响

张小琴,王友翠,谢俊霞

(青岛大学基础医学院生理学与病理生理学系,山东 青岛 266071)

帕金森病(PD)是仅次于阿尔茨海默病的第二大神经退行性疾病[1-9]。PD主要的病理特征是中脑黑质多巴胺(DA)能神经元大量变性丢失，导致纹状体内DA含量减少，而变性丢失的 DA能神经元内均出现α-突触核蛋白积聚[10-13]。环状RNA是一类不具有5′末端帽子和3′末端 poly(A)尾巴、以共价键形成环形结构的RNA分子。由于呈闭合环状结构，对核酸外切酶不敏感，因此环状RNA比线性RNA更为稳定，且具有物种保守性、组织时序性及疾病表达特异性[14-20]。有文献报道，环状RNA小脑变性相关蛋白1反义转录物(CDR1as)可作为miR-7海绵调控miR-7靶基因的表达[21-22]。已有研究表明，α-突触核蛋白基因的拷贝增加或点突变均可导致α-突触核蛋白积聚，从而引发PD[23-24]。而miR-7可以与α-突触核蛋白基因编码 mRNA的3′UTR 区相互作用，从而抑制其翻译[25-26]。这提示作为miR-7海绵的CDR1as基因可能参与了DA能神经元的变性丢失。因此，阐明CDR1as基因在PD中发挥的作用至关重要。本研究旨在探讨经1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)处理的PD细胞模型中CDR1as基因的表达变化。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及其来源

MPP+(M0896)由美国Sigma公司提供，用双蒸水稀释至10 mmol/L，分装，-20 ℃避光保存；DMEM高糖基础培养液(01-052-1ACS)购自BI公司；TRIzol购自ambion公司；PCR逆转录试剂盒(AG11711)和SYBR Green(AG11702)购自艾科瑞生物公司；胎牛血清(澳洲源，FND500)购自依科赛公司；青霉素和链霉素混合双抗液(F1400)购自索莱宝公司。

1.2 细胞培养

小鼠神经母细胞瘤N2a细胞培养于含体积分数0.05胎牛血清、100 kU/L青霉素和100 mg/L链霉素混合双抗的DMEM高糖培养液中，在37 ℃、体积分数0.05 CO2条件下培养。

1.3 四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞活力

将N2a细胞接种于96孔板中，每孔细胞悬液200 μL(细胞数为8×104个)，培养24 h后，弃上清，对照组直接加入新鲜基础培养液，MPP+组加入终浓度为100 μmol/L的MPP+，分别处理3、6、9和12 h。细胞处理结束后，每孔加入5 g/L的MTT 20 μL，培养4 h后取出培养板，弃上清，每孔加入100 μL的二甲基亚砜(DMSO)，振荡10 min。用酶标仪检测波长570 nm处的吸光度(A)值，计算细胞存活率。

1.4 实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测CDR1as基因表达

将传代N2a细胞接种于12孔板，分为对照组(A组)和100 μmol/L MPP+处理3、6、9、12 h组(B、C、D、E组)。采用TRIzol法冰上裂解各组细胞5 min。按照PCR逆转录试剂说明书操作，提取细胞总RNA。取1 μg的总RNA，加入1 μL gDNA Clean Reagent、2 μL 5×gDNA Clean Buffer，用RNA free water补至10 μL，42 ℃变性2 min；随后向上述反应体系中加入Evo M-MLV RTase Enzyme Mix 1 μL、RT Primer Mix 1 μL、5×RTase Reaction Buffer Mix Ⅰ 4 μL、RNA free water 4 μL，37 ℃作用15 min，继以85 ℃、5 s逆转录合成cDNA。采用SYBR Green染料法相对定量测定CDR1as基因的表达。RT-PCR 检测所用引物及其序列见表1。应用2-ΔΔCt方法计算目的基因相对表达量。

表1 RT-PCR检测所用引物序列

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 MPP+作用不同时间对N2a细胞存活率影响

与对照组相比较，经100 μmol/L MPP+作用3、6、9和12 h的N2a细胞存活率均有明显下降，差异具有统计学意义(t=2.283～11.430，P<0.05)。见表2。

表2 MPP+处理不同时间对N2a细胞存活率的影响

2.2 MPP+作用不同时间后N2a细胞中CDR1as基因的表达变化

RT-PCR检测结果显示，A、B、C、D、E组N2a细胞中CDR1as基因的表达水平分别为1.070±0.338、0.207±0.034、0.290±0.039、0.354±0.121和0.368±0.137(n=6)。与对照组比，经100 μmol/L MPP+作用3、6、9和12 h的N2a细胞CDR1as基因表达水平明显降低，差异均具有显著意义(F=10.010，q=7.003～8.609，P<0.05)。

3 讨 论

PD是世界上第二大常见的神经退行性疾病，随着人口老龄化加剧，发病人数逐年增加[1-9]。PD主要病理学特征是黑质区DA能神经元进行性丢失，纹状体DA含量降低。临床上主要表现为肌僵直、静止性震颤、姿势不稳、运动迟缓，影响了病人的生活质量[27]。左旋多巴是治疗PD的常用药物，但大多数病人长期服用左旋多巴后出现不自主运动、认知障碍、痴呆等副作用[28]。因此，寻找新的治疗靶点具有重要的意义。近期研究发现，CDR1as参与PD的发病进程，但其确切的机制尚未阐明。

研究表明，CDR1as基因在人和小鼠脑组织中可有效地环化，而检测不到线性CDR1as[29]。人源CDR1as基因序列含有74个miR-7结合位点，小鼠CDR1as基因序列含有130个miR-7结合位点，且在不同物种间高度保守[21-22,29]。CDR1as与miR-7共同高表达于脑组织神经元的胞体和突起，在小脑、中脑、海马、嗅球神经元中均能检测到CDR1as基因的表达[29-30]。研究发现，CDR1as基因在兴奋性神经元中表达水平较高，CDR1as基因敲除小鼠表现出兴奋性突触诱发电位功能障碍[29]。在斑马鱼胚胎中过表达人源CDR1as会导致中脑体积缩小，其表型与miR-7缺失相似，且通过补充miR-7前体可部分恢复中脑体积，提示CDR1as可能是通过与miR-7相互作用，即作为miR-7海绵吸附miR-7而发挥作用[19]。有文献报道，在PD病人和1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶诱导的PD小鼠的中脑黑质区，miR-7的表达均显著降低，在小鼠中脑黑质区敲低miR-7，则会导致α-突触核蛋白积聚并伴有DA能神经元的变性丢失，同时纹状体内DA含量显著下降，提示miR-7可能在α-突触核蛋白的转录后调节中发挥重要作用[31-32]。此外，miR-7在调节PD发病进程中的神经炎症和DA能神经元死亡中具有重要作用[33-36]。因此，CDR1as可能通过调节miR-7-α-突触核蛋白轴调控PD的发展。本研究应用浓度为100 μmol/L的MPP+处理N2a细胞构建PD细胞模型，并检测了CDR1as在不同时间点的变化，结果显示，N2a细胞经过MPP+处理3、6、9和12 h后CDR1as表达显著降低，提示CDR1as基因可能间接参与了PD的发病。

有研究显示，在CDR1as基因敲除小鼠大脑中，miR-7的表达减少而不是增加，这表明还有其他机制参与了miR-7表达的调节[29]。采用CLIP-Seq技术对miR-7-target RNA-Ago2嵌合体中的靶序列进行分析和排序发现，无论是在人类还是小鼠大脑中，排在第1位的都是CDR1as基因，排在第2位的是长链非编码RNACyrano，提示Cyrano在中枢神经系统中对miR-7具有重要的调控作用[29]。Cyrano高表达于脑神经元的胞体和突起，含有1个与miR-7几乎完全配对(除第9/10位外)的结合位点，且该位点高度保守[37]。然而，Cyrano是否通过miR-7在PD发病中发挥作用还需进一步探究。

研究表明，在人类和小鼠脑中，CDR1as基因也存在miR-671的结合位点，miR-671可以近乎完全与CDR1as基因互补配对，随后与Ago2蛋白结合，最终实现对CDR1as基因的有效降解，且此相互作用在物种间高度保守，提示这种特异性的相互作用可能具有重要生物学功能[29,38]。本研究中，N2a细胞经过MPP+处理3、6、9和12 h后CDR1as基因表达显著降低，这一现象是否与miR-671有关还需进一步研究。

综上所述，N2a细胞经过MPP+处理3、6、9和12 h后CDR1as基因表达水平显著降低，本文结果为研究CDR1as基因在PD发病中的作用提供了实验依据。