帕金森病模型小鼠PV和NOS阳性神经元数目变化

曹中凯,陈凤华,谢俊霞,石丽敏

(青岛大学医学部基础医学院生理学与病理生理学系，山东 青岛 266071)

帕金森病(PD)是一种常见的神经退行性疾病，主要病理特征为黑质致密带多巴胺能神经元进行性丢失及纹状体轴突末梢多巴胺含量减少[1-3]。PD病人可出现静止性震颤、肌僵直及运动迟缓等多种运动症状及便秘、睡眠障碍等多种非运动症状[4-5]。近年来，越来越多的临床研究表明，在未定带进行深部电刺激能够改善PD病人的运动症状[6-8]。未定带位于丘脑腹侧，被认为是底丘脑的一部分，主要分为头端、背侧、腹侧和尾侧四部分，其中背侧和腹侧是其中心区域，主要分布一氧化氮合酶(NOS)阳性神经元和小清蛋白(PV)阳性神经元[9-10]。尽管临床证据提示未定带与PD密切相关，然而在PD发病过程中，未定带PV及NOS阳性神经元的数目是否发生改变目前尚不清楚。本实验选用经典神经毒素1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)制备PD小鼠模型，通过免疫荧光技术观察MPTP对未定带PV及NOS阳性神经元数目的影响，为了解未定带在 PD 进展和治疗中的作用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物及主要试剂

选择SPF级雄性C57BL/6小鼠，7周龄，体质量(22±2)g，购自北京维通利华公司。小鼠饲养于25 ℃、昼夜循环光照条件下，可自由饮水、摄食、活动，实验前适应环境1周。MPTP购自美国Sigma公司，酪氨酸羟化酶(TH)抗体购于美国Millipore公司，PV抗体购于美国Abcam公司，NOS抗体和驴抗兔二抗购于美国Thermo Fisher公司，其他试剂均为国产分析纯。

1.2 分组及给药方法

将小鼠随机分为对照组和MPTP组，每组6只。MPTP组小鼠给予MPTP连续5 d腹腔注射，剂量为30 mg/(kg·d)；对照组则以等量生理盐水代替MPTP。

1.3 脑标本采集

麻醉小鼠后，固定其四肢，暴露心脏，将静脉注射针头小心插入左心室同时剪开右心耳。先后用9 g/L NaCl及40 g/L多聚甲醛溶液(用0.1 mol/L PBS配制，pH值7.2～7.4，现用现配，4 ℃避光保存)对小鼠进行灌注。待小鼠肝脏由红色变为黄白且四肢和尾部僵直时，停止灌注操作。取出小鼠的大脑，用40 g/L多聚甲醛溶液固定过夜，再先后用200 g/L及300 g/L蔗糖溶液(0.1 mol/L PBS配制)脱水，待大脑沉底，脱水完成。

1.4 脑组织切片及免疫荧光染色

用恒温冷冻切片机(Leica，CM1950)进行冷冻切片。切片时，提前30 min开机进行机器预冷，并将脑组织用包埋剂OCT(Sakura Finetek)包埋、固定在冻头托上。将小鼠脑组织切成厚度为20 μm的脑片，黑质及未定带两个部位的脑片分别按先后顺序切成完整的4套，将脑片置于含有0.01 mol/L PBS溶液的12孔板中，每次进行免疫荧光实验时取出完整的1套进行染色。染色时，将脑片取出，用40 g/L多聚甲醛溶液固定5 min，以PBS清洗3次(每次10 min)，用含体积分数0.05驴血清(Jackson)的PBST缓冲液室温封闭1 h，加一抗4 ℃冰箱孵育过夜。次日，用PBS清洗3次，每次10 min；加PBST稀释的荧光二抗室温孵育2 h；用PBS清洗3次，每次10 min；用体积分数0.70的甘油(ddH2O配制)封片，避光保存。实验中用到的一抗分别为anti-nNos (1∶300，rabbit)、anti-parvalbumin (1∶100，rabbit)和anti-tyrosine hydroxylase(1∶1 000，rabbit)；实验中用到的二抗分别为donkey anti-rabbit488和donkey anti-rabbit 555，稀释比为1∶500。在Olympus光学显微镜下拍片，应用OlyVIA软件进行计数。由于染色的是4套脑片中的1套，故先计数该套脑片在20倍物镜下未定带及黑质区阳性神经元个数，再乘以4即可得到未定带NOS、PV阳性神经元和黑质区TH阳性神经元的个数。

1.5 统计学分析

2 结 果

与对照组相比较，MPTP组黑质区TH阳性神经元数目减少，差异有统计学意义(t=6.888，P<0.01)；未定带PV阳性神经元和NOS阳性神经元数目均明显减少，差异均有统计学意义(t=3.618、15.390，P<0.01)。见表1。

表1 两组小鼠TH、PV和NOS阳性神经元数目比较

3 讨 论

未定带是底丘脑的重要核团，处于大脑神经轴的中央位置，位于丘脑底核和大脑脚的背侧、内侧丘系的外侧[11]。未定带与皮质、中脑、下丘脑、脑干、脊髓等多个脑区存在广泛的投射，参与机体多种功能的调控，影响摄食、姿势与运动、睡眠与觉醒、大脑皮质发育、神经病理痛等多种生理病理过程[12-21]。近年来，越来越多的临床研究显示，在未定带进行深部电刺激后PD病人的震颤、运动迟缓等症状得到有效缓解，其效果等同于或者优于传统的丘脑底核电刺激，且无明显副作用，术后病人认知、吞咽及语言功能均未受影响，提示未定带是治疗PD的安全有效的作用靶点[22-28]。神经病毒示踪显示，未定带与基底神经核诸多核团之间存在投射关系，它接受来自黑质网状带/苍白球内侧部的抑制性γ-氨基丁酸(GABA)输入以及黑质致密带的多巴胺能投射，同时发出兴奋性谷氨酸能投射到黑质致密带，因此也被建议纳入基底神经核的范畴[29-31]。尽管临床研究和基础解剖联系均提示未定带与PD密切相关，然而目前未定带参与PD病变的具体神经细胞机制尚不清楚。

本研究关注的是未定带NOS和PV阳性神经元。未定带以GABA能神经元为主，但细胞异质性强，由于神经化学标志物的表达不同又分为多种亚型。其中，NOS阳性神经元主要分布在背侧未定带，PV阳性神经元集中分布在腹侧未定带，背侧和腹侧构成了未定带的中心区域。这些不同亚型的GABA能神经元与不同核团之间存在广泛的纤维投射，参与机体对多种运动行为的调节。例如，激活未定带PV阳性神经元-丘脑后内侧核团环路可以增强声音诱导的逃跑行为[14]；前扣带回皮质-未定带NOS阳性神经元环路参与了小鼠探索运动的调控[32]。为验证PD过程中未定带的PV及NOS阳性神经元的数量是否会发生改变，本研究利用经典神经毒素MPTP制备PD小鼠模型，首先通过免疫荧光技术检测到黑质区TH阳性神经元数目减少，证实黑质多巴胺能神经元损伤，PD模型建立成功，进而观察到未定带NOS和PV阳性神经元数目较对照组显著减少。

然而，神经化学标志物NOS和PV的表达为何受到影响目前尚不清楚。本实验采用连续5 d腹腔注射MPTP方法制备亚急性PD小鼠模型。MPTP是一种经典的神经毒素，其本身没有毒性，但极易通过血-脑脊液屏障，进入脑内后在单胺氧化酶B的作用下转变为MPP+，后者经细胞膜上的多巴胺转运体进入多巴胺能神经元，阻断线粒体电子传递系统，导致能量代谢障碍和自由基的生成增加，最终导致多巴胺能神经元损伤[33-34]。我们推测，黑质致密带多巴胺能神经元的丢失可能会影响到从黑质致密带到未定带的多巴胺能投射，进而抑制未定带中PV、NOS阳性神经元这两种GABA能神经元的表达。此外，黑质多巴胺能神经元的损伤也可以引起其他多个脑区神经元电活动的异常，如皮质和脚桥核，而这两个核团与未定带也有密切的纤维投射[25,35-37]。因此，黑质多巴胺能神经元可能通过上述直接或者间接投射，影响了未定带PV及NOS阳性神经元的数目变化。本实验初步观察了PD中未定带区域PV阳性神经元及NOS阳性神经元的数目变化，为阐明PD影响未定带神经元的病理表达提供了初步的实验证据。