纤维母细胞生长因子3对前丘脑γ-氨基丁酸能抑制性轴突的排斥作用

黄 红，余舒扬，张蔚云，肖 俐，徐贞刚，刘 芳

丘脑是机体重要的感觉传导接替站，来自全身的感觉传导通路(除嗅觉外)，均在丘脑内更换神经元，并通过丘脑皮质轴突投射到大脑皮质[1]。丘脑含有两类主要的神经元群：抑制性的γ-氨基丁酸能(γ-aminobutyric acid, GABA)神经元和位于后丘脑的兴奋性谷氨酸能神经元[2]。其中，前丘脑GABA抑制性神经元伸出的轴突对兴奋性谷氨酸能神经元起着重要的调节作用。例如，精神分裂症、阿尔茨海默病的发生，均与前丘脑GABA抑制中间神经元的功能缺陷有关[3-5]。然而，与大量关于大脑皮层抑制作用发展的研究相比，丘脑抑制作用的形成与成熟机制尚不清楚。

纤维母细胞生长因子(fibroblast growth factors, FGFs)构成了一个多肽生长因子的大家族。在脊椎动物中， FGFs被化分为7大亚族[6]。研究[7]表明，在早期发育中 FGF7亚族的FGF3和FGF10调节下丘脑正中隆起基底细胞的分化，但在下丘脑发育后期， FGF3和FGF10 能作为化学趋化因子指导下丘脑轴突抵达正中隆起[8]。这提示表达在下丘脑FGF3也许是另一类对丘脑具有化学导向作用的分子，引导着邻近前丘脑GABA抑制性神经元轴突的生长。

1 材料与方法

1.1 主要试剂FGF3(美国R&D公司)；SU5402(德国Calbiochem公司)；鼠尾胶原蛋白I型(美国R&D公司)；Affigel beads (美国Pharmacia Biotech公司)；DMEM、M199、胎牛血清(美国Gibco公司)；中性蛋白酶(美国Thermo Fisher公司)；anti-FGF3(美国Ablonal公司，1 ∶200)； anti-TUJ1(英国Abcam公司，1 ∶800)、anti-PV(北京博奥森公司，1 ∶400)；二抗Alexa Fluor 488、568(美国ThermoFisher公司，1 ∶800)；亲脂性羰花青染料(lipophilic carbocyanine dye，DiI)(南京凯基生物科技发展有限公司)。

1.2 三维组织培养将受精种鸡蛋(江西省种鸡场)孵育在温度为39℃、湿度为60%的培养箱中5～6 d。中性蛋白酶(20 min, 1 mg/ml)消化分离神经外胚层与中胚层。分离的神经外胚层组织块将依据已发表的技术和方法[8]培养在胶原蛋白凝胶中，48 h后检测观察。

1.3 免疫荧光胚胎(n≥6)和组织块(n≥6)的免疫组织化学分析是依据已发表技术在冰冻切片或整体组织块上进行[7]。样本滴加Ⅰ抗(封闭液中)后，室温静置1 h或者4 ℃ 过夜。PBST 洗涤3次，加Ⅱ抗室温孵育2 h，PBST(PBS+0.1% Triton X-100)洗涤3次,封片，Olympus ix70倒置荧光显微镜下观察。

1.4 DiI示踪亲脂性羰花青染料DiI是神经生物实验中常用的荧光示踪剂。分离E6鸡胚大脑，将DiI(5 mg/ml无水乙醇)注入后丘脑，固定于4%多聚甲醛中1个月。PBS充分清洗后，显微追踪前丘脑GABA抑制性神经纤维的生长。

2 结果

2.1 FGF3与PV在间脑的表达及定位首先使用免疫荧光法确定FGF3在鸡胚间脑(丘脑和下丘脑)的表达。在E5， FGF3 的表达扩展到下丘脑的背侧区域(图1B)。PV是前丘脑成熟GABA神经元标志性基因。E5前丘脑横切面(图1A)的免疫荧光结果显示，PV在前丘脑有着广泛的表达(图1C)。

2.2 下丘脑源FGF3对前丘脑GABA轴突的导向作用为检测GABA神经纤维进入丘脑的时期，本研究将DiI注入E6鸡胚后丘脑，并置于4%PFA固定四周。荧光显示：已有少量前丘脑GABA抑制性神经纤维平行延伸并在丘脑背侧汇合(图2A)，说明在E6时期前丘脑GABA抑制性神经纤维已进入丘脑。

为了验证下丘脑源的FGF3的轴突导向功能，本研究进行了三维组织共同培养实验。间脑不同区域组织块被解剖出来，并放入三维胶原蛋白凝胶中培养48 h(图1D)。将E5前丘脑组织块单独培养或与PBS珠子共培养时，在胶原蛋白凝胶中几乎没有观察到神经纤维长出组织块(图2B、2C)。当前丘脑组织块与下丘脑组织块共培养时，研究结果显示，下丘脑组织块排斥前丘脑神经轴突：轴突伸出凝胶并向远离下丘脑组织块的方向生长(图2D、2G)。免疫荧光结果显示，FGF3 和PV分别在下丘脑和前丘脑组织块表达，表明组织块解剖的正确性(图2E、2F)。TUJ1抗体可识别class III-tubulin微管蛋白，因此能标记正在发育的前体神经细胞及纤维。使用TUJ1与PV抗体共同标记前丘脑轴突显示，被下丘脑排斥的TUJ1轴突中含有大量前丘脑GABA抑制性轴突(图2H、2I)。

图1 FGF3、PV在间脑的表达与组织块分离示意图A：鸡胚间脑结构示意图；虚线：纵切线；B：FGF3在下丘脑的表达；C：PV在E5鸡胚前丘脑的表达；D：鸡胚间脑组织块分离示意图；Tel：端脑；T：丘脑；PT：前丘脑；HT：下丘脑；B、C：×200

为检测下丘脑源的FGF3是否参与了前丘脑GABA神经元轴突的路径选择，采用FGF3的珠子与前丘脑组织块共培养实验。与单独培养的前丘脑组织块相比(图2B)，FGF3珠子(300 ng/ml)能显著促进前丘脑TUJ1+轴突在凝胶中的生长[n=6，(4.33±1.21)vs(38.00±6.72)轴突束，t=12.072，P<0.01](图3A)；并且，前丘脑轴突的数量在近侧(FGF3侧)明显少于远侧(远离FGF3侧)[n=6，(5.50±1.05)vs(32.50±7.31)轴突束，t=8.950，P<0.01]。并且，在这些被排斥的轴突中，含有大量PV+ GABA神经纤维(图3B)。为了确定FGF信号是否参与前丘脑GABA抑制性神经纤维的引导作用，前丘脑组织块暴露于FGFR抑制剂SU5402(20 μmol/L)之中。培养基中含有SU5402时，FGF3珠子无法引导前丘脑GABA神经纤维的生长方向；胶原凝胶中只有少量前丘脑轴突(图3C)。

图2 下丘脑组织块对前丘脑GABA抑制性轴突生长具有导向作用A：DiI示踪结果；B：前丘脑组织块单独培养；C：前丘脑组织块与PBS珠子共培养；D：前丘脑与下丘脑组织块共培养；E：FGF3在下丘脑组织块的表达；F：PV在前丘脑组织块的表达；G：前丘脑与下丘脑组织块共培养； H：共培养中前丘脑GABA轴突被PV标记；I：共培养中前丘脑GABA轴突被TUJ1标记；A、B、C、D、G：× 40

图3 FGF3对前丘脑GABA轴突生长的影响A：FGF3珠子与前丘脑组织块共培养；B：PV+的前丘脑GABA轴突标记；C: FGF3珠子、前丘脑组织块、SU5402的共培养；A、C：×40

3 讨论

中枢神经系统是由许多神经细胞组成的，这些神经细胞通过神经纤维形成的功能回路对建立正常、有序的中枢系统是极为重要的。在轴突生长过程中，轴突顶端的生长锥能检测到周围环境中的导向因子；导向因子通过吸引或排斥轴突的方式帮助轴突找到通往目标的正确路途[9]。研究[10]表明，几类组织形态发生分子，如Hhs、骨形态发生因子(BMPs)、Wnts和FGFs被报道是远程轴突导向因子。组织形态发生分子是一种可扩散的蛋白质，通过产生长程浓度梯度来提供模式信息。这些形态发生的模式化功能始于发育的早期阶段，因此有理由推测，在胚胎发育后期，形态发生分子的残存梯度可为后期神经元轴突的导向提供方向信息[10]。在间脑内，FGF3与FGF8协同作用，指导前丘脑的结构雏形的形成；然而，对FGF3和FGF8在丘脑发育后期的轴突导向作用却不包括在这些研究中[11-12]。

本研究结果显示，在E5前丘脑的新生轴突延伸过程中，FGF3的表达广泛存在于下丘脑中。在下丘脑，FGF10也有表达，但FGF10只表达在腹侧的正中隆起，离丘脑有较远的距离[8]；而FGF3在发育后期，在下丘脑背侧有着较为广泛的表达，距离丘脑较近。这些都提示FGF3也可能是下丘脑中的一种长程扩散性轴突趋化信号，指引着邻近前丘脑GABA纤维的路径选择。为了进一步了解GABA抑制性神经纤维的走向，使用DiI体外跟踪GABA抑制性神经纤维的生长。DiI是一种红色晶体，荧光强而稳定,可沿脂质膜扩散，有良好的轴突特异性。实验结果显示，在E6，已有少量前丘脑纤维进入了(后)丘脑。因此，选择E5鸡胚间脑组织块，进行三维凝胶共培养实验。三维凝胶神经组织培养能最大程度模拟神经组织在体内生长的立体三维环境，但又能避免体内复杂因素的制约，是目前神经生物学常用实验方法。有研究[13-14]表明，当环境中没有轴突导向因子时，大部分轴突不会向组织块外生长，而是围绕着组织块边缘生长；但是，当环境中存在导向因子时，轴突才会向组织块外生长，表现为被吸引或被排斥。本研究结果显示下丘脑组织块对前丘脑神经纤维有着化学排斥作用；而来自下丘脑的FGF3能模拟下丘脑组织块的功能，可刺激前丘脑轴突在三维凝胶中的生长，并指导相邻的前丘脑GABA轴突向后丘脑的方向延伸，构成有效的大脑抑制环路的一部分。在所有被排斥的轴突中，有部分轴突并不是前丘脑PV+的神经纤维，这说明FGF3也许对丘脑的另外一种重要神经纤维(丘脑皮质轴突，TCAs)也具有导向作用：排斥TCAs进入下丘脑，帮助TCAs转弯进入内囊，从而投射大脑皮层。同时，通过抑制FGF通路的分析，揭示了FGF3对前丘脑GABA轴突发育的直接作用。这些结果说明，来源于下丘脑的FGF3在前丘脑GABA轴突导向中不可或缺的作用；下丘脑源的FGF3排斥前丘脑轴突向后丘脑延伸以调节兴奋性谷氨酸能神经元的功能。前丘脑GABA神经元功能的失调已证实与阿尔茨海默病、癫痫、精神分裂及失眠等疾病相关，因此，FGF3对前丘脑GABA抑制性轴突的导向作用是理解丘脑内抑制性神经网络形成机制的基础，并将可能进一步解决此区域神经损伤与再生等重要临床问题，具有潜在的应用价值。