α-突触核蛋白高表达对PC12细胞ferroportin、铁调节蛋白1和铁调素表达的影响

王雪,宓晓晴,宋宁

(青岛大学医学部基础医学院生理学与病理生理学系,山东 青岛 266071)

帕金森病(PD)是一种缓慢进展的神经退行性疾病，以运动障碍、肌僵直、静止性震颤及姿势反射障碍等为特征性表现，其主要病理学特征是黑质致密部多巴胺能神经元的丢失以及纹状体多巴胺释放减少[1-5]。PD病因涉及遗传、环境和衰老等多种因素，但确切病因尚不完全清楚[6]。α-突触核蛋白(α-Syn)聚集体构成的路易小体广泛存在于PD受损的多巴胺能神经元中，被认为是PD发病机制的关键因素。α-Syn是由140个氨基酸组成的蛋白，以分子伴侣的形式参与多项生理功能，但其聚集体会导致线粒体功能障碍，诱发内质网应激，破坏内质网-高尔基体转运等[7-10]。铁是人体必需的微量元素之一，其缺乏会导致细胞死亡，但过量的铁也具有细胞毒性[11-16]。铁会随着年龄的增加沉积于黑质等脑区，但是这种现象在PD中尤为严重。细胞内的铁通过ferroportin(FPN)从细胞中转出。FPN是一种跨膜的铁转出蛋白，是目前唯一已知的细胞内铁释放的通路，主要受铁调节蛋白和铁调素调节[17]。近年来大量研究表明，细胞内铁沉积和α-Syn聚集存在紧密的相互作用，共同参与多巴胺能神经元损伤，并可能导致PD病理的恶性循环[18]。α-Syn调控铁代谢的机制尚未阐明，本实验旨在探究α-Syn高表达对PC12细胞FPN、铁调节蛋白1(IRP1)蛋白表达和铁调素mRNA水平的影响。

1 材料与方法

1.1 实验细胞及主要试剂

PC12细胞由英国剑桥医学研究所医学遗传系David C. Rubinsztein教授馈赠。该细胞携带人源野生型(WT)α-Syn基因，在NheⅠ/SalⅠ位点将该基因插入pTRE2hyg载体，并在该载体中插入调控转基因表达的多西环素(DOX)开关。DMEM高糖培养液、胎牛血清和马血清均购于美国Gibco公司，DOX购于美国Sigma公司；α-Syn抗体购于美国CST公司，FPN抗体购于以色列Alomonelabs公司，IRP1抗体购于英国Abcam公司，兔抗β-actin购于中国博奥森公司，羊抗兔IgG购于中国爱必信公司；TRIzol和PCR逆转录试剂盒购于美国Thermo Fisher公司，SYBR Green购于美国QIAGEN公司，铁调素引物购于中国Takara公司。

1.2 细胞分组与处理

将PC12细胞用完全培养液(DMEM高糖培养液168.9 mL、胎牛血清10.0 mL、马血清20.0 mL、潮霉素B 0.3 mL、G418 0.8 mL)重悬后，以3×108/L的密度接种于6孔板内，每孔2 mL，当细胞融合达到80%左右时将其分为对照组和DOX处理组，分别用基础培养液(DMEM高糖培养液)和2 mg/L的DOX处理24 h。共进行3次独立实验。

1.3 免疫印迹法检测α-Syn、FPN和IRP1蛋白的表达

药物处理24 h后，使用RIPA裂解液提取蛋白，应用BCA试剂盒检测提取蛋白的浓度，按照每孔20 μg计算上样量，加入Loading Buffer，95 ℃加热蛋白5 min，将蛋白样本进行电泳(电压为80 V和120 V)，然后将蛋白转移至PDVF膜上(电流为300 mA)。用50 g/L的牛血清清蛋白封闭2 h后分别加入α-Syn、FPN、IRP1、β-actin一抗，于4 ℃摇床上孵育过夜。用TBST洗30 min后加入二抗室温孵育1 h，以TBST洗30 min后应用ECL发光液显影。应用Image J软件进行分析，α-Syn、FPN和IRP1蛋白表达水平以三者与β-actin灰度值之比来表示。

1.4 实时荧光定量PCR检测铁调素mRNA表达

每1 mL TRIzol试剂裂解的样品中加入0.2 mL的氯仿室温孵育2～3 min，于4 ℃下以12 000 r/min离心15 min。取上层水相并加入异丙醇，以上述同样条件离心10 min，用体积分数0.75的乙醇清洗后，使用反转录试剂盒进行反转录合成cDNA。采用SYBR Green染料法定量检测基因的表达。按照说明书进行PCR体系循环扩增，使用2-ΔΔCt法计算目的基因相对于内参照基因GAPDH的表达量。PCR引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 DOX对PC12细胞α-Syn表达的影响

对照组和DOX处理组细胞内α-Syn蛋白表达水平分别为1.001±0.331和2.851±0.137(n=6)，DOX处理组α-Syn蛋白表达水平是对照组的2.85倍，差异有统计学意义(t=5.245，P<0.05)。

2.2 α-Syn 高表达对PC12细胞FPN和IRP1蛋白表达的影响

对照组和DOX处理组细胞内FPN蛋白表达水平分别为1.000±0.032和0.993±0.063(n=6)，IRP1蛋白表达水平分别为0.998±0.107和0.965±0.042(n=6)，DOX处理组细胞内FPN蛋白表达水平是对照组的99.3%，IRP1蛋白表达水平是对照组的96.9%，DOX处理组FPN和IRP1蛋白表达水平与对照组比较没有明显变化，差异无显著意义(t=0.092、0.268，P>0.05)。

2.3 α-Syn高表达对PC12细胞铁调素mRNA水平的影响

对照组和DOX处理组细胞内铁调素mRNA表达水平分别为1.003±0.044和1.365±0.069(n=5)，DOX处理组铁调素mRNA表达水平较对照组升高36.1%，差异有统计学意义(t=4.162，P<0.05)。

3 讨 论

铁是维持神经结构和功能所必需的微量元素之一。然而，在PD病人的黑质致密部观察到铁特异性地沉积，部分多巴胺能神经元观察到铁水平升高[17,19]。在生理条件下，铁参与了多巴胺的合成；然而，过量的铁诱导产生活性氧(ROS)，会导致脂质、蛋白质和DNA的不可逆损伤[20]。在黑质致密带幸存的多巴胺能神经元的路易小体中，铁染色最为明显，证明铁与α-Syn的大量共同存在，提示铁沉积和α-Syn聚集密切相关[21]。已有文献报道了α-Syn对铁代谢的影响，例如α-Syn可以结合三价铁和二价铁形成α-Syn-铁络合物[22]。此外，α-Syn具有铁还原酶的作用，可催化三价铁还原为二价铁，过量的α-Syn导致细胞内铁水平增加和三价铁、二价铁的比例失调[23]。最近有研究表明，在高表达α-Syn的SH-SY5Y细胞和A53Tα-Syn转基因小鼠中，α-Syn可以上调铁转入蛋白二价金属离子转运体(DMT1)的表达且不依赖铁反应元件(IRE)/IRP1系统，可能与泛素-蛋白酶体的降解异常有关，这可能导致了α-Syn高表达时细胞内铁沉积[24]。目前，α-Syn对铁转出蛋白FPN的表达影响尚不清楚。本实验观察到，PC12细胞α-Syn高表达时其FPN表达没有发生明显变化，说明α-Syn高表达时出现的泛素-蛋白酶体降解异常并不足以调控FPN表达变化。

FPN的表达主要受到铁调节蛋白和铁调素的调控。FPNmRNA 5′端非编码区含有一个IRE，在细胞内高铁的情况下，IRE与铁调节蛋白的结合减少，因此对FPNmRNA翻译的抑制减弱，导致FPN蛋白表达增多[25-26]。与铁调节蛋白2(IRP2)相比，IRP1与IRE的亲和力更高[27]。本文研究结果显示，PC12细胞内α-Syn高表达对FPN和IRP1蛋白的表达均没有明显影响。我们推测，在α-Syn高表达的细胞中，虽然文献报道DMT1表达上调，但细胞外液中铁水平较低，并没有造成细胞内铁沉积，因此也不会导致IRP1和FPN的表达变化。

铁调素是一种由肝脏合成和分泌的小多肽，被认为是人体铁稳态的主要调节者。铁调素通过与细胞膜上的铁转出蛋白FPN结合诱导其泛素化从而导致FPN内化和降解，以此来控制FPN在膜上的表达和细胞的铁释放[28-29]。本研究结果显示，高表达α-Syn的PC12细胞中铁调素mRNA水平上调。有文献报道，α-Syn可激活核因子κB(NF-κB)信号传导通路释放白细胞介素6，后者可以通过信号转导和转录激活促进铁调素的转录[30-31]。因此我们推测，铁调素表达上调与细胞内α-Syn蓄积有关，但具体机制需进一步证实。虽然铁调素表达上调，但本实验并没有观察到FPN的表达变化，这与铁调素的作用具有组织细胞特异性的报道相一致，例如在肠细胞中，铁调素不会改变FPN水平但会降低DMT1的表达[24,32-33]。由于铁调素分子量只有9 000，很难用常规免疫印迹方法检测其蛋白水平，因此其蛋白水平是否发生变化尚无法确定。此外，DOX处理诱导α-Syn过表达虽然引起了铁调素mRNA表达水平上调，但其时间(只有24 h)和表达量(约1.5倍)可能并不足以造成α-Syn异常聚集和调控FPN表达变化。

综上所述，在PC12细胞中，高表达α-Syn 24 h对铁转出蛋白FPN和铁调节蛋白IRP1表达均无明显影响，但可显著上调铁调素的表达水平。本文结果为α-Syn调控细胞内铁代谢提供了实验依据。