非小细胞肺癌c⁃MET、BRAF、ROS1基因突变与临床特征的关系

周荣根 王燕 陈基升 董森森

肺癌是临床常见的一种恶性肿瘤，有着较高发病率和死亡率，其中以非小细胞肺癌（non⁃small cell lung cancer，NSCLC）最为常见，其占所有肺癌类型的80%～85%，包括腺癌、鳞癌、腺鳞癌等。早期诊治有助于控制病情发展，延长患者生存期［1］。近年来，随着对肺癌发病机制及其生物学行为研究的不断深入，临床日益聚焦以特异性高、副作用小为特征的基因分子靶向治疗。靶向基因测序是一种很有前景的检测方法和手段，可为基因检测降低材料使用和减少检测时间。常规检测ALK、ROS1基因突变在晚期NSCLC 诊治中已成为诊断共识。研究发现，除这些基因突变外，c⁃MET基因突变也是NSCLC 发生及对EGFR⁃TKI 药物耐药的一个机制［2］。本研究通过检测确诊为NSCLC 患者病灶组织中c⁃MET、BRAF、ROS1基因突变表现，并与临床病理特征的关系，为临床靶向诊治提供潜在新靶点和依据，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取南阳市第二人民医院胸外科2019年1月至2022年2月诊治的82 例NSCLC 初诊患者，均为经影像学、病理学检查等确诊，符合《肺癌筛查与管理中国专家共识》相关诊断标准［3］。其中，男性44例，女性38 例；平均年龄（56.9±5.6）岁；病理类型：腺癌69 例，鳞癌13 例；肿瘤分期：Ⅰ期14 例，Ⅱ期23 例，Ⅲ期35 例，Ⅳ期10 期；吸烟史：有48 例，无34 例；淋巴转移：有39 例，无43 例；肿瘤侵润深度：T1 14 例，T2 20 例，T3 30 例，T4 18 例。纳入标准：①年龄≥18 岁；②肺癌TNM 分期为Ⅰ～Ⅳ期；③均接受手术或病理检查；④临床依从性良好；⑤所有患者对研究知情并同意。排除标准：①伴精神障碍或意识不清楚者；②预计生存期<3 个月者；③临床资料不全者；④有药物过敏史者。收集所有患者手术切除或穿刺活检石蜡包埋病灶组织切片标本。收集所有患者手术切除或穿刺活检石蜡包埋病灶组织切片标本。本研究经院伦理委员会批准。

1.2 方法

①提取：根据试剂盒说明书，使用QIAamp DNA微量核酸提取试剂盒（Qiagen, Heidelberg, Germa⁃ny）和QIAamp DNA FFPE 组织试剂盒（Qiagen,Heidelberg, Germany）从冷冻组织和FFPE 样本中提取DNA。 使用NanoDrop1000 分光光度计（NanodropTechnologies，Wilmington，USA）和Qubit量子荧光计（Invitrogen，Carlsbad，USA）对DNA 浓度进行定量。利用安捷伦2100 生物分析仪（Agi⁃lent，Saint Clara, USA）使用高灵敏度DNA 试剂评估碎片状态，以产生DNA 完整性数（DIN）。此外，还进行了质量控制（QC）步骤，以通过多重聚合酶链反应（PCR）评估FFPE DNA 的完整性。②针对靶向基因测序，定制了一个由23 个肿瘤相关基因组成的panel。通过E220 聚焦超声仪Covaris（Covaris，Woburn，MA，USA）对每个样本中的300纳克gDNA 进行机械破碎和片段化。DNA 片段的目标大小在150 到200 bp 之间。然后，使用KAPA文库制备试剂盒（KAPA Biosystems Inc.，Wilming⁃ton，USA）将10⁃100 ng DNA 用于文库构建，按照该试剂盒制造商的说明，通过末端修复、加A 拖尾和接头连接构建。最后，使用xGen 锁定探针池（IDT 技术）捕获NGS 文库，并使用1×KAPA HiFi热启动Ready Mix 通过12⁃13 个PCR 周期扩增捕获的DNA 片段。然后在Illumina Nova 测序仪上使用150PE 模式对文库产物进行测序。以>3000×的平均覆盖率对FFPE 样本和>200×的平均覆盖率对配对的样本进行测序，并记录相关数据。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0 软件包进行数据分析；计数资料以n（%）表示，通过卡方检验、Fisher 精确检验对各基因与临床病理特征进行组间比较；以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者c⁃MET、BRAF、ROS1 基因突变情况

病理HE 染色见图1，可见肿瘤细胞呈簇状、片状或散在排列，胞核染色质粗糙、核仁清晰，胞质丰富。c⁃MET基因突变占比36.59%，BRAF基因突变占比15.85%，ROS1基因突变占比6.10%；c⁃MET与ROS1基因突变共存有1 例，占比1.22%。见表1。

图1 NSCLS 病灶组织HE 染色图（HE 染色，×400）Figure 1 HE staining of NSCLS focal tissues（HE staining，×400）

表1 NSCLS患者c⁃MET、BRAF、ROS1基因突变比例［n（%）］Table 1 Proportion of c⁃MET，BRAF and ROS1 gene mutations in NSCLS patients［n（%）］

2.2 c⁃MET 基因突变与临床病理特征的关系

c⁃MET基因突变型与野生型在性别、年龄、肿瘤分期、病理类型方面比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2 c⁃MET 基因突变和NSCLC 病理特征的关系［n（%）］Table 2 Relationship between c⁃MET gene mutation and PATHOLOGICAL features of NSCLC［n（%）］

2.3 BRAF 基因突变与临床病理特征的关系

BRAF基因突变型的肿瘤侵润深度整体低于野生型，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

表3 BRAF 基因突变和NSCLC 病理特征的关系［n（%）］Table 3 Relationship between BRAF gene mutation and PATHOLOGICAL features of NSCLC［n（%）］

2.4 ROS1 基因突与临床病理特征的关系

ROS1基因突变型的男性占比、年龄、有吸烟史占比、鳞癌及腺癌及临床Ⅲ期、Ⅳ期占比均低于野生型，差异有统计学意义（P<0.05）。见表4。

表4 ROS1基因突变与NSCLC临床病理特征的关系［n（%）］Table 4 Relationship between ROS1 gene mutation and clinicopathological features of NSCLC［n（%）］

3 讨论

当前，临床采取的个体化靶向治疗主要是针对EGFR突变型的NSCLC，此种NSCLC 有着明确的基因靶点及相关检测技术、靶向药物，临床治疗效果提升。之后在肺癌中越来越多驱动基因被发现，包括ROS1、c⁃MET、BRAF等。

ROS1是一种酪氨酸激酶胰岛素受体基因，已在数种肿瘤细胞株中检测出高表达［4⁃5］。其染色体重排是NSCLC 一个新亚型，为独特的受体酪氨酸激酶，在进化上和ALK 有着密切关系［6］。有研究表明［7］，小分子酪氨酸激酶抑制剂对ROS1基因重排具有较显著的的抗肿瘤活性，ROS1能够作为潜在的靶向治疗分子。本研究结果表明女性、年龄≤60 岁、吸烟者、晚期腺癌患者的ROS1基因突变率较高。从临床病例看，ROS1突变患者多见于年轻患者，与文献报道基本一致［8］。

目前，c⁃MET基因已成为NSCLC 靶向治疗的新热点［9］。在NSCLC 中，c⁃MET蛋白异常活化可通过多种机制发生。临床研究认为c⁃MET基因突变与NSCLC 患者的性别、年龄、吸烟状态、肿瘤组织类型和临床分期无相关性［10］，但本研究发现c⁃MET基因突变与患者与性别、年龄、肿瘤分期、病理类型有关。但c⁃MET基因的突变、扩增、表达等概率较低，研究显示［11］，c⁃MET基因发生14外显子跳跃性突变与扩增概率仅2%～6%与1%～5%。

BRAF基因作为RAF基因家族中重要一员，其基因突变类型以V600E 常见，在BRAF突变中可占大约90%［12］。本研究发现，BRAF基因在肿瘤浸润深度T3、T4 患者中突变率较高。相关研究表明［13］，BRAF基因突变型NSCLC 患者无法从抗EGFR 单抗治疗中获益，且BRAF基因突变的转移性NSCLCD 预后差，突变患者无进展生存期和总生存期较野生型的患者明显缩短。有研究对NSCLC 患者进行基因检测，发现BRAF与ALK双基因突变发生率约0.3%［14］。

一般认为，同一患者中ROS1融合基因突变与c⁃MET基因突变不共存，但近期随着ROS1基因与c⁃MET基因检测的推广及检测人群增加，相继出现两者基因突变共存个案报道，大部分为女性，无吸烟史，病理类型大部分为腺癌较年轻患者。本研究中，c⁃MET与ROS1基因突变共存为1.22%，与相关报道相符。与传统观点认为ROS1融合基因会导致c⁃MET突变患者对酪氨酸激酶抑制剂耐药不同，研究显示对c⁃MET和ROS1共存突变患者加用相应抑制剂治疗，可提高患者的总体生存率。本研究结果意味着部分NSCLC 患者可用靶向药克唑替尼治疗。

综上，c⁃MET基因突变易发生于女性、年龄≤60岁以及不吸烟及腺癌的患者，ROS1基因突变好发于腺癌患者，BRAF可能与肿瘤侵润深度有关。