甲状腺乳头状癌患者临床病理特征和BRAF V600E基因突变对其颈部淋巴结转移的影响

姬 巍,董 健,昌 红,杜雪梅,彭 洪,谢 洪,赵爱民,闫 巍,白 娟,彭振兴,尹金淑

（1.首都医科大学附属北京世纪坛医院耳鼻喉科，北京 100038；2.首都医科大学附属北京世纪坛医院放射科，北京 100038；3.首都医科大学附属北京世纪坛医院病理科，北京 100038；4.首都医科大学附属北京世纪坛医院结直肠外科，北京 100038；5.首都医科大学附属北京世纪坛医院肝胆外科，北京 100038）

甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是甲状腺最常见的恶性肿瘤，约占所有甲状腺癌的80%～90%［1-3］。PTC恶性程度相对较低，5年生存率可达90%以上，但少部分侵袭性PTC恶性程度高，容易发生淋巴结及远处转移［3-6］，如何准确诊断颈部淋巴结是否转移，在PTC患者的分期中具有重要意义［2-3］。BRAF V600E是PTC的原癌基因，约40%～50%的PTC患者可出现该基因的突变［7-9］，BRAF V600E基因突变与颈部淋巴结转移是否具有关联性仍有争议［4，8-10］。本研究通过回顾性分析321例PTC患者资料，总结其临床特征、原发灶和颈部转移淋巴结的病理特点，同时结合BRAF V600E基因是否突变，以期明确PTC患者颈部淋巴结转移的危险因素。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集2017年1月—2020年12月因甲状腺恶性占位在本院行手术治疗的患者，纳入标准：①行甲状腺肿瘤切除并行颈部淋巴结清扫的初次手术，最终病理结果证实为PTC的患者；②术后行BRAF V600E基因检测者。排除标准：①其他任何病理类型的甲状腺占位者；②术前行任何其他PTC占位治疗者，包括手术和碘131放射治疗等；③PTC伴其他部位转移而未行手术治疗者；④并发其他甲状腺疾病者，如结节性甲状腺肿、甲状腺功能亢进和桥本氏甲状腺炎等患者。

1.2 数据收集 收集入组患者的临床、病理和基因检测资料，包括患者年龄，性别，肿瘤部位、大小和病灶数量，淋巴结转移的数量和分区，BRAF V600E基因检测结果。PTC手术所得样本和淋巴结均进行病理学检查，对肿瘤组织样本进行常规制片，应用罗氏HE600染色机及配套染液进行HE滴染后，采用蔡司AX10显微镜光镜进行观察，放大倍数为100和200倍。PTC原发灶的评价指标：原发灶的位置和最大径，是否有包膜侵犯，是否有瘤周纤维包裹，是否检出砂粒体，是否有周围脉管和神经受累。按照原发灶数量和位置分为3组：单个原发灶且位于甲状腺单侧叶，多个原发灶位于甲状腺单侧叶，多个原发灶且位于甲状腺双侧叶。PTC转移淋巴结的评价指标：转移淋巴结的位置、分区和数目，与原发灶是否位于同侧。当患者甲状腺双侧叶均有PTC原发灶，而只有一侧淋巴结转移时，定义为原发灶与转移的淋巴结位于同侧，进而对PTC原发灶和转移淋巴结进行关联性分析。

1.3 BRAF V600E基因检测 采用实时荧光定量PCR （real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）法检测肿瘤组织中BRAF V600E基因突变。对比HE染色在显微镜下标记肿瘤区域，切片过程中仅选取相关肿瘤区域，避免选择出血和钙化的区域。切取厚度为5 μm蜡膜5张于洁净的EP管中，严格做到每一个病例应用一个新的切片，并采用乙醇进行相关器具的消毒处理。应用艾德FFPE DNA提取试剂对石蜡组织样本进行DNA提取。提取后应用紫外分光光度计测量DNA质量和浓度。按照测量的DNA浓度稀释至5 μg·L－1备用。应用ADx-ARMS-B-RAF检测试剂盒（厦门艾德生物医药科技有限公司），按照试剂盒说明和实验室标 准 操 作 规 程 （standard operating procedure，SOP）应用SLAN96全自动医用PCR分析系统对样本进行BRAF V600E突变基因检测。反应体系为50 μL，于PCR第3阶段60℃时采集FAM及HEX信号。根据样本CT值判读结果。若样本FAM信号扩增曲线呈S型且CT值≤30，则该样本为阳性。

1.4 统计学分析 采用SPSS 25.0统计软件进行统计学分析。计量资料（包括患者年龄和肿瘤最大径）以±s表示，2组间样本均数比较采用两独立样本t检验，计数资料（包括患者性别、被膜侵犯、淋巴细胞浆细胞浸润、瘤周纤维包裹和BRAF V 600E基因类型构成等）组间比较采用χ2检验或Fisher精确概率法。对于淋巴结转移的相关因素分析，首先筛选出与之相关的因素，进而采用向前逐步回归法进行多因素Logistic回归分析，最终结果采用比值比（odds ratio，OR）和95%置信区间（95%confidence interval，95%CI）进行描述。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般资料 本研究共收集PTC患者321例，其中男性96例，女性225例，年龄13～73岁，平均年龄（42.3±12.1）岁，PTC最大径范围0.1～6.0 cm，平均（1.15±0.91）cm。本组PTC患者中，原发灶位于甲状腺一侧245例，其中单侧单原发灶者204例，单侧多原发灶者41例，双侧均可见原发灶者76例。病理学检测结果：有包膜侵犯者137例，检出砂粒体者21例，淋巴浆细胞浸润者77例，原发灶周围可见纤维包裹者114例，脉管侵犯者13例，神经侵犯者8例。BRAF V600E基因突变者279例（86.9%）。见表1。

2.2 颈部淋巴结转移阳性组和阴性组PTC患者的临床和病理特征及BRAF V600E基因检测结果 根据是否发生颈部淋巴结转移，PTC患者分为颈部淋巴结转移阳性组和阴性组，颈部淋巴结转移阳性组和阴性组PTC患者性别、单侧叶内原发灶数量、被膜侵犯、淋巴细胞浆细胞浸润、瘤周纤维包裹、神经侵犯和BRAF V600E基因类型比较差异无统计学意义（P＞0.05），而患者发病年龄、肿瘤最大径、甲状腺双侧叶多原发灶、检出砂粒体和脉管受侵方面比较差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。见表1。

表1 PTC患者临床病理特征和基因检测结果Tab. 1 Clinico pathological characteristics and gene detection results in PTC patients [n（η/%）］

2.3 不同数量和位置原发灶PTC患者的颈部淋巴结转移特点 PTC患者按照原发灶数量和位置分为3组，包括单个原发灶位于甲状腺单侧叶者70例，多个原发灶位于甲状腺单侧叶者19例，多个原发灶位于双侧叶者40例，各组患者转移淋巴结数量、位置和颈部转移淋巴结分区结果见表2。各组患者淋巴结转移数量和分区比较差异无统计学意义（P＞0.05），淋巴结转移位置比较差异有统计学意义（P＜0.01）。见表2。

表2 不同数量和位置原发灶PTC患者颈部淋巴结转移特点Tab. 2 Charateristics of cervical lymph node metastasis in PTC patients with different number and locations of primary tumor［n（η/%）］

2.4 PTC患者颈部淋巴结转移的多因素Logistic回归分析 采用多因素Logistic回归分析，以是否发生颈部淋巴结转移作为因变量，以PTC患者年龄、性别、肿瘤最大径、病灶数、检出砂粒体和脉管受侵情况为自变量，通过向前逐步法构建Logistic回归模型。赋值参照既往文献［11-12］制定。见表3。

表3 PTC患者各变量定义和赋值Tab. 3Definition and assignment of different variables in PTC patients

多因素Logistic回归分析结果显示：PTC患者年龄与PTC发生颈部淋巴结转移呈负相关关系（β=－0.316，P=0.001），即随着年龄增长，发生淋巴结转移的风险降低。而肿瘤最大径（β=0.586，P＜0.01）、 原 发 灶 数 量 （β=0.666，P=0.005）、检出砂粒体 （β=0.947，P=0.042）和脉管受侵（β=2.181，P=0.005）与PTC患者颈部淋巴结转移呈正相关关系，即肿瘤最大径、原发灶数量、病灶中检出砂粒体和脉管受侵是PTC发生淋巴结转移的影响因素。见表4。

表4 PTC患者颈部淋巴结转移的影响因素分析Tab. 4 Analysis on influencing factors of cervical lymph node metastasis in PTC patients

3 讨 论

甲状腺癌是一种常见的内分泌肿瘤，其发病率在原发恶性肿瘤中位于第6位，PTC是其中最常见的病理组织类型，约占所有甲状腺恶性肿瘤的85%［2-3，13］。PTC是一种分化良好的甲状腺癌，治疗方式包括外科手术治疗、促甲状腺激素抑制治疗和放射性碘治疗［2-3］。PTC治疗方式的选择主要基于临床危险度分级，其预后则受患者年龄、性别、淋巴结转移和BRAF V600E基因突变等因素影响［1，6，14］。研究［1，6］表明：对于年龄小于 45岁的PTC患者，如果有颈部淋巴结转移，其预后往往不佳，建议选择更积极的治疗方式。近年来，随着PTC发生率不断升高，侵袭性PTC逐渐为人们所认知，部分研究者［7，9，15-16］认为：侵袭性 PTC 与BRAF V600E基因突变有关，然而其临床和病理特点的关联性至今仍存在争议。本研究结果表明：PTC颈部淋巴结转移主要影响因素包括患者年龄、肿瘤最大径、原发灶数量、病灶中检出砂粒体和脉管受侵犯。

本研究中，40.2%的PTC患者发生淋巴结转移，年龄小于40岁的患者占颈部淋巴结转移者总数的57.3%，提示年龄是PTC发生颈部淋巴结转移的相关因素之一；将PTC患者按发病年龄分层，随着年龄的增加，颈部淋巴结转移的百分率进行性降低，提示年轻PTC患者更易发生颈部淋巴结转移。本研究结果与有关文献［4-5，8，14，17］报道中，小于45岁的PTC伴颈部淋巴结转移患者往往肿瘤恶性度高、易于复发和远处转移且需要采用更积极的治疗方式等结果相一致，提示年龄是PTC发生颈部淋巴结转移的保护性因素。

本研究结果表明：PTC原发灶的最大径、数量、检出砂粒体和脉管受侵是发生颈部淋巴结转移的危险因素，与既往文献［18］报道相一致。肿瘤的最大径是重要危险因素之一，本研究将肿瘤最大径进一步分层，结果表明：随着肿瘤最大径的增加，颈部淋巴结转移率上升。此外，本研究结果显示：脉管受侵和检出砂粒体是颈部淋巴结转移的危险因素，两者均提示肿瘤的侵袭性更强，发生颈部淋巴结转移的比例更高。但本研究中，所得组织样本中检出砂粒体的患者仅占6.5%，远低于有关文献［19］，需要进一步扩大样本证实。

PTC原发灶的位置、数量与颈部淋巴结转移有关联。本研究结果表明：PTC原发灶与颈部转移淋巴结常位于同侧，但与淋巴结的具体分区，如位于颈部中央区、侧颈区或两区均有，则无明显关联，可能与原发灶的转移遵循淋巴引流途径，倾向于发生同侧颈部淋巴结转移有关。此外，是否存在颈部淋巴结转移也与PTC原发灶数量有关，大于5个原发灶的患者发生颈部淋巴结转移的比例明显提高，是颈部淋巴结转移的影响因素，与既往报道［4-5，17，20-22］一致。

本研究中86.6%的PTC患者出现BRAF V600E基因突变，提示PTC发生该基因突变的比例非常高，明显高于既往文献［4，7-8，10，15，23］报道的 40%～50%。 研 究［15，18，24-25］表 明：BRAF V600E 基 因 是PTC的主要原癌基因，可以发生在多种肿瘤中，如恶性黑色素瘤、卵巢癌和结直肠转移癌。BRAF V600E基因突变与肿瘤的恶性程度密切关联，如与腺体外浸润、分期、淋巴结或远处转移甚至高死亡率有关［9，16，26-28］，提示本研究中纳入的 PTC 样本肿瘤恶性度高，需采用更积极的治疗方式［29-31］。但本研究中BRAF V600E基因突变与颈部淋巴结转移并无相关性，提示BRAF V600E不是PTC颈部淋巴结转移的危险因素，需要进一步扩大样本进行研究。

本研究具有一定的局限性：①本组患者淋巴结转移的分区评价并未按照美国甲状腺协会指南的颈部淋巴结7分区法，由于本研究时间跨度过长，部分早期病例中采用的是传统中央区和侧颈区的划分方法所致；②本研究只针对PTC患者的临床和病理特征与BRAF V600E基因之间的关系进行研究，并未纳入TNM分期、治疗方式的选择和预后评价；③本研究仅纳入PTC患者，并未纳入并发其他甲状腺疾病的患者，如桥本氏甲状腺炎和结节性甲状腺肿等。

综上所述，PTC患者发生颈部淋巴结转移的临床和病理特征关联因素包括肿瘤最大径、原发灶数量、检出砂粒体和脉管受侵犯。BRAF V600E基因突变与颈部淋巴结转移之间无关联性。多因素Logistic回归分析表明：PTC患者发生颈部淋巴结转移的影响因素包括患者年龄、肿瘤最大径、原发灶数量、检出砂粒体和脉管受侵。对肿瘤直径＞1 cm、发病年龄≤40岁和多个原发灶的PTC患者，其发生颈部淋巴结转移的风险较高，推荐采用更积极的干预措施，降低患者危险因素，改善预后。