隔药饼灸对动脉粥样硬化易损斑块兔RhoA/ROCK1信号通路及PI3K、Akt、mTOR表达的影响

饶泽华，吴雪芬，马逸杰，廖意娟，宋家薇，易丽贞，刘欣，岳增辉

湖南中医药大学针灸推拿学院，湖南 长沙 410208

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是以动脉内膜脂质沉积、纤维组织增生及炎性细胞浸润为特征的慢性疾病。易损斑块是AS中以大量泡沫细胞聚集及纤维帽变薄为特征的不稳定斑块，斑块破裂形成血栓是心血管病致死的最主要原因，因此稳定斑块是防治AS的重要策略。巨噬细胞是斑块中最主要的细胞，在AS后期，巨噬细胞凋亡可促进斑块破裂。细胞自噬可促进巨噬细胞胆固醇转出，维持细胞稳态，减少脂质累积，从而稳定斑块。因此，调控细胞自噬可能是治疗AS的新方向。研究表明，Ras 同源物基因组成员A（RhoA）/Rho 同源物相关卷曲螺旋蛋白激酶（ROCK）信号通路能调节肌动蛋白聚合及细胞骨架重排，对巨噬细胞吞噬、迁移等功能具有调节作用，通过多个途径参与AS形成。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是调节细胞自噬的关键蛋白，磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）是mTOR上游的关键调节因子，抑制PI3K/Akt/mTOR 通路可诱导细胞自噬，而激活ROCK可使mTOR活化。隔药饼灸通过在穴位上敷贴药饼，借助艾灸的温热作用促进药物吸收，更好地治疗疾病。研究表明，隔药饼灸可通过调节血脂水平影响AS 的发展进程，并通过抑制RhoA/ROCK1信号通路稳定易损斑块，但RhoA/ROCK1是否通过介导PI3K/Akt/mTOR通路相关蛋白表达，调节细胞自噬功能，目前并不清楚。因此，本研究观察隔药饼灸对AS 易损斑块兔RhoA/ROCK1 信号通路及PI3K、Akt、mTOR表达的影响，深入研究其稳定AS易损斑块的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级雄性新西兰大耳白兔70只，体质量1 800～2 200 g，湖南太平生物科技有限公司提供，动物许可证号SYXK（湘）2020-0005。单笼饲养于湖南中医药大学动物实验中心，室温25 ℃、湿度50%～70%环境，12 h明暗交替。本实验经湖南中医药大学实验动物伦理委员会批准（LL2019081905）。造模用高脂饲料，湖南嘉泰实验动物有限公司提供，由83.8%基础饲料＋1%胆固醇＋10%蛋黄粉＋5%猪油＋0.2%丙基硫氧嘧啶组成。

1.2 药物及制备

丹参、郁金、山楂、泽泻、大黄药粉，湖南中医药大学第一附属医院中药房提供，按等比例取3～5 g药粉用陈醋调成糊状，制成厚2～3 mm、直径0.8～1.2 cm药饼。Rho激酶抑制剂盐酸法舒地尔，上海源叶生物科技有限公司，货号32087。阿托伐他汀钙片，美国辉瑞公司，批号1237304。

1.3 主要试剂与仪器

艾炷（南阳昊翔药业，5 mm×10 mm），斑点蝰蛇毒（广西医科大学蛇毒研究所制备），Ad5-p53重组载体（深圳赛百诺基因技术有限公司，批号20130602），组胺（上海三杰生物技术有限公司，批号20110901），乌拉坦（国药集团化学试剂有限公司，批号20190419），载脂蛋白A（APO-A）ELISA试剂盒（江苏晶美，货号GR-E72284），载脂蛋白B（APO-B）ELISA试剂盒（江苏晶美，货号GR-E72285），RhoA抗体（湖南艾方生物科技有限公司，货号AF03289），HE染色液、DAB显色剂、ROCK1 抗体（武汉赛维尔生物科技有限公司，货号分别为G1005、G1211、GB11265）。导引导管（145 cm×0.84 mm）、球囊扩张导管[（3.0～3.5 mm）×15 mm]、手推式球囊扩张压力泵（30 atm，1 atm＝101.325 kPa）、导引导丝（0.14 mm×195 cm），美国Cordis公司；台式高速冷冻离心机（北京大龙仪器，型号D3024R）；立式冷藏陈列柜（浙江星星科技股份有限公司，型号LSC-316C）；卧式冷冻箱（合肥美菱公司，型号BCD-318AT）；高速组织研磨仪（武汉赛维尔生物科技有限公司，型号KZ-II）；超薄切片机（德国Leica公司，型号UC7）；酶标仪（美国Rayto公司，型号RT-6100）；凝胶成像系统（美国Alpha Innotech公司，型号alphaEase FC）；显微镜（日本Nikon公司，型号E100）。

1.4 分组及造模

参照Phinikaridou等研究，采用高脂饲料喂养＋腹主动脉球囊损伤＋基因转染＋药物触发斑块破裂的方法制备AS易损斑块模型。所有动物适应性喂养1周后，按随机数字表法分为空白组10只和手术组60只，空白组予普通饲料喂养，手术组予高脂饲料喂养。2周后对手术组兔行腹主动脉球囊损伤术：耳缘静脉注射20%乌拉坦（5 mL/kg）麻醉兔，肝素钠200 U/kg 抗凝。将兔固定于兔台，右后肢大腿内侧剪毛备皮，络合碘常规消毒，在股动脉搏动明显处沿股动脉走行方向切开皮肤，游离右股动脉约2 cm，结扎股动脉远心端，动脉夹夹闭近心端，在股动脉近心端穿线打一活结备用。将股动脉剪一小口，送入导引导丝，松开动脉夹，沿导引导丝将球囊导管导入腹主动脉，长度约20 cm。用球囊扩张压力泵向球囊注入肝素钠生理盐水，并保持压力泵读数为6～8 atm，抗阻力牵拉球囊导管至髂动脉，抽空球囊，45 s后再次将球囊导管送入20 cm处，重复3次。术后结扎股动脉近心端，逐层缝合消毒，连续3 d 肌肉注射青霉素（40 万U/d）预防感染。

手术过程死亡5只，剩余55只兔采用随机数字表法分为模型组、直接灸组、隔药饼灸组、西药组和抑制剂组，每组11只。术后各组兔继续予高脂饲料喂养并进行相应干预，连续8周。

干预结束后停止高脂饲料喂养，改为普通饲料，对所有手术组兔进行腹主动脉斑块局部基因转染。选取左后肢大腿内侧股动脉，术前准备及送入球囊导管操作同腹主动脉球囊损伤术，用球囊扩张压力泵向腹主动脉局部注入滴度为1.0×10VP/mL的Ad5-p53重组载体20 μL，术后操作同前，基因转染时间2周。

药物触发共2次，分别于动物处死前48、24 h腹膜下注射斑点蝰蛇毒（0.15 mg/kg），30 min后耳缘静脉注射组胺（0.02 mg/kg），以诱发斑块破裂。

1.5 干预方法

于腹主动脉球囊损伤术后对各组兔进行相应干预，具体操作为：空白组和模型组只固定，不干预，每次30 min，每日1次；直接灸组将兔固定于兔台，剪毛，取穴定位参照《实验针灸学》及拟人比照法制定，取穴分2组，1组“巨阙”、双侧“天枢”“丰隆”，2组双侧“心俞”“肝俞”“脾俞”，将直径0.5 cm的艾炷（下有纸制垫盘）粘于穴位上，点燃施灸，待艾炷燃完且余热散尽后，再换另一壮，每穴每日灸3 壮（约30 min），2组穴位隔日交替施灸；隔药饼灸组将兔固定于兔台，剪毛取穴定位，将提前制作好的药饼贴于穴位上，将艾炷的垫盘去除后放置于药饼上点燃施灸，其余操作同直接灸组；西药组将阿托伐他汀钙片研磨成粉，按1.96 mg/（kg·d）剂量拌入高脂饲料中，每日固定相同时间，不施灸；抑制剂组每日分2次经耳缘静脉注射盐酸法舒地尔10 mg/（kg·d），每日固定相同时间，不施灸。各组连续干预8周。

1.6 取材

取材前12 h禁食不禁水，耳缘静脉注射20%乌拉坦（5 mL/kg）麻醉兔，仰卧固定于兔台，腹部剪毛后，沿腹中线开腹，游离主动脉弓至髂总动脉分叉处主动脉全长，采血针平行血管进针，取动脉血2 mL于抗凝管中，3 000 r/min离心10 min，将血清转移至新的EP管，置于-20 ℃冰箱保存备用。采血完成后，用眼科剪将腹主动脉剪下，生理盐水冲洗，剪取约2 cm腹主动脉置于4%多聚甲醛溶液中浸泡固定24 h以上，剩余腹主动脉置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.7 检测指标

1.7.1 一般情况观察

每日观察兔精神状态、动作灵敏性、反应敏捷性、毛发光泽度、体质量变化、饮食量、饮水量及大小便情况。

1.7.2 ELISA检测

取离心后血清，ELISA检测APO-A和APO-B含量，严格按试剂盒说明书操作，酶标仪波长450 nm处测量各孔吸光度（OD值），计算血清APO-A和APO-B含量。

1.7.3 HE染色

取出4%多聚甲醛固定的腹主动脉，蒸馏水冲洗，选取斑块形成处进行脱水、浸蜡、包埋、切片（4 μm），石蜡切片常规脱蜡至水，Harris苏木素染色5 min，蒸馏水洗，1%盐酸酒精分化30 s，蒸馏水洗，梯度乙醇脱水，伊红染色5 min，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察，采用MIASE图像分析系统测量腹主动脉内膜、内膜-中膜厚度。

1.7.4 免疫组化检测

取适量腹主动脉，常规脱水、浸蜡、包埋、切片、脱蜡、抗原修复、过氧化氢灭活、血清封闭。滴加RhoA一抗（1∶100）、ROCK1一抗（1∶100），4 ℃孵育过夜，滴加HRP标记山羊抗兔二抗（1∶200），室温孵育50 min，DAB显色，苏木素衬染，冲洗、封片后，显微镜下观察，采用Aipathwell图像分析系统计算阳性表达的平均光密度。

1.7.5 Western blot检测

取适量腹主动脉，加入裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，80 μg蛋白上样，电泳后将蛋白转至硝酸纤维素膜，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，分别加入PI3K、Akt、mTOR一抗（均为1∶1 000），4 ℃孵育过夜，加入二抗（1∶5 000），室温孵育1 h。ECL发光液显影，凝胶成像系统成像，采用Quantity One 4.4.0软件进行分析，以目的蛋白与内参蛋白灰度值比值计算目的蛋白相对表达量。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 隔药饼灸对模型兔一般情况的影响

最终存活50只兔，其中空白组8只、模型组9只、直接灸组9只、隔药饼灸组7只、西药组9只、抑制剂组8只。模型组兔精神状态不佳，活动减少，毛发光泽度降低，体质量增加，大便颜色加深，小便混浊；各干预组兔精神状态不佳，行动迟缓，其他无显著差异。

2.2 隔药饼灸对模型兔血清载脂蛋白A和载脂蛋白B含量的影响

与空白组比较，模型组兔血清APO-A含量显著减少，APO-B含量显著增加（＜0.01）；与模型组比较，直接灸组、隔药饼灸组和西药组兔血清APO-A含量显著增加（＜0.05，＜0.01），APO-B 含量显著减少（＜0.05，＜0.01），抑制剂组兔血清APO-A含量显著增加（＜0.01）；与直接灸组比较，隔药饼灸组兔血清APO-B含量显著减少（＜0.01）；与隔药饼灸组比较，西药组兔血清APO-B含量显著增加（＜0.05）。见图1。

图1 各组兔载脂蛋白APO-A、APO-B含量比较（，每组7～9只）

2.3 隔药饼灸对模型兔腹主动脉病理形态的影响

空白组兔腹主动脉血管内皮组织结构完整，内膜薄且紧贴内弹性板，中膜平滑肌细胞排列整齐；模型组兔腹主动脉内膜明显增厚，可见大量泡沫细胞聚集，脂质累积形成斑块，向管腔内凸起致管腔狭窄，纤维帽薄且脂核较大，斑块内可见多处出血，管腔内可见血栓，中膜平滑肌细胞排列紊乱；直接灸组兔腹主动脉内膜增厚，有斑块形成；隔药饼灸组兔腹主动脉内膜可见泡沫细胞聚集，管腔内有斑块，中膜平滑肌细胞结构紊乱，弹力纤维排列不规则；西药组兔腹主动脉内膜明显增厚，有斑块形成，中膜平滑肌细胞排列整齐；抑制剂组兔腹主动脉内膜可见泡沫细胞聚集并形成斑块，表层为厚薄不一的纤维帽，中膜结构紊乱，弹力纤维结构不清，管腔内可见少量不溶性纤维蛋白及红细胞。见图2。

图2 各组兔腹主动脉形态（HE染色，×200）

与空白组比较，模型组兔腹主动脉内膜、内膜-中膜厚度显著增加（＜0.01）；与模型组比较，直接灸组、隔药饼灸组和西药组兔腹主动脉内膜、内膜-中膜厚度显著减少（＜0.01，＜0.05）。见图3。

图3 各组兔腹主动脉内膜、内膜-中膜厚度比较（，每组7～9只）

2.4 隔药饼灸对模型兔腹主动脉RhoA和ROCK1表达的影响

与空白组比较，模型组兔腹主动脉RhoA 和ROCK1表达显著升高（＜0.01）；与模型组比较，直接灸组、隔药饼灸组、西药组和抑制剂组兔腹主动脉RhoA和ROCK1表达显著降低，差异均有统计学意义（＜0.01）。见图4～图6。

图4 各组兔腹主动脉RhoA表达（免疫组化染色，×400）

图5 各组兔腹主动脉ROCK1表达（免疫组化染色，×400）

图6 各组兔腹主动脉RhoA和ROCK1表达比较（，每组7～9只）

2.5 隔药饼灸对模型兔腹主动脉PI3K、Akt、mTOR蛋白表达的影响

与空白组比较，模型组兔腹主动脉PI3K、Akt、mTOR蛋白表达显著升高（＜0.01）；与模型组比较，隔药饼灸组兔腹主动脉Akt、mTOR蛋白表达显著降低（＜0.05，＜0.01），西药组兔腹主动脉Akt蛋白表达显著降低（＜0.05），抑制剂组兔腹主动脉PI3K、mTOR蛋白表达显著降低（＜0.05），其余差异无统计学意义（＞0.05）；与直接灸组比较，西药组和抑制剂组兔腹主动脉PI3K蛋白表达显著降低（＜0.01）；与隔药饼灸组比较，抑制剂组兔腹主动脉PI3K蛋白表达降低（＜0.05）。见图7、图8。

图7 各组兔腹主动脉PI3K、Akt、mTOR蛋白表达比较（，每组7～9只）

图8 各组兔腹主动脉PI3K、Akt、mTOR蛋白免疫印迹

3 讨论

AS典型病变是在大、中动脉局部出现内膜增厚、大量脂质沉积，由单核细胞衍生的巨噬细胞及平滑肌细胞通过摄取脂蛋白形成泡沫细胞，坏死的泡沫细胞及组织碎片形成病变深部糜粥样柔软部分，凸出于管腔表面，覆以较坚硬的纤维被膜，形成粥样斑块。不稳定斑块破裂后形成血栓堵塞血管可引发严重的急性心血管事件。易损斑块具有较大的脂质核心、较多的巨噬细胞浸润，以及薄的纤维帽。本实验HE染色显示，模型组兔腹主动脉部分斑块脂核较大，可见大量巨噬细胞浸润，纤维帽变薄，与易损斑块特点基本一致，提示AS易损斑块模型制备成功。隔药饼灸组、西药组兔腹主动脉损伤程度稍减轻，均未见血栓形成或出血，且内膜、内膜-中膜厚度显著减少，提示干预后斑块稳定性增加。

脂质代谢紊乱与AS发生发展关系密切，APO-A和APO-B是评价血脂的重要指标，APO-B存在于所有致AS脂蛋白中，可直接反映致AS脂蛋白含量，与AS发展呈正相关。研究表明，低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）可导致AS，降低LDL-C含量可减少心血管事件的风险。APO-B是LDL-C的主要构成蛋白，降低APO-B含量可抑制AS形成。APO-A是高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）主要成分，参与激活卵磷脂胆固醇酰基转移酶，并能结合周围组织中的游离胆固醇，促进胆固醇逆转运，减少脂质累积，抑制AS 的发展。本实验结果显示，模型组兔血清APO-A含量显著减少，APO-B含量显著增加，直接灸组、隔药饼灸组和西药组兔血清APO-A含量显著增加，APO-B含量显著减少，表明3种干预方法均可改善AS易损斑块兔载脂蛋白含量，抑制AS发展。且在调节APO-B含量方面，隔药饼灸效果最优。

RhoA是超家族中单体小分子G蛋白的成员之一，ROCK1为RhoA下游的效应分子，RhoA/ROCK信号通路能调节肌动蛋白聚合和细胞骨架重排，激活ROCK可促进细胞黏附分子的分泌，增加巨噬细胞黏附聚集，促进AS 的发展。研究表明，抑制RhoA/ROCK可促进Beclin1激活下游自噬相关通路，增加自噬水平。本实验结果显示，模型组兔腹主动脉RhoA和RCOK1表达显著升高，提示RhoA/ROCK1信号通路被激活，隔药饼灸组兔腹主动脉RhoA和ROCK1表达显著降低，表明隔药饼灸干预可抑制RhoA/ROCK1信号通路，稳定易损斑块，延缓AS。

自噬是真核生物降解和回收利用细胞内生物大分子及受损细胞器的过程，巨噬细胞源性泡沫细胞通过诱导自噬促进胆固醇逆转运、调节胆固醇流出、减少脂质累积，延缓AS斑块形成。调控自噬可能是治疗AS 的潜在方法。研究发现，抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路能促进巨噬细胞自噬。赵瑞翔等也发现，抑制miR-1可显著提高PI3K、Akt、mTOR蛋白磷酸化水平，降低细胞Beclin1蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值，抑制自噬小体形成，表明抑制miR-1表达可激活PI3K/Akt/mTOR信号通路，抑制细胞自噬。mTOR参与调节细胞生长、凋亡和自噬等，是自噬的关键蛋白。PI3K/Akt 是mTOR 上游的调节因子，活化的Akt使TSC1/2复合物解离，导致Rheb-GTP浓度增加，从而激活mTOR生成mTORC1，磷酸化自噬相关因子丝氨酸/苏氨酸激酶1（ULK1），阻碍自噬小体形成，抑制细胞自噬。当mTORC1活性被抑制，ULK1去磷酸化形成ULK复合体启动自噬。PI3K/Akt/mTOR信号通路在细胞自噬中发挥重要作用，且与AS关系密切。本实验采用Western blot 检测兔腹主动脉PI3K、Akt、mTOR蛋白表达，结果显示，模型组兔腹主动脉PI3K、Akt、mTOR蛋白表达显著升高，提示AS发生后PI3K/Akt/mTOR信号通路被激活，细胞自噬水平下降。隔药饼灸组兔腹主动脉Akt、mTOR蛋白表达降低，提示隔药饼灸干预可抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路，提高细胞自噬水平。同时，抑制剂组兔腹主动脉PI3K、mTOR 蛋白表达降低，表明抑制RhoA/ROCK1信号通路可降低PI3K、Akt、mTOR表达。

综上所述，隔药饼灸可能通过抑制RhoA/ROCK1信号通路，降低Akt、mTOR 蛋白表达，抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路，促进细胞自噬，改善血脂水平，减轻腹主动脉病理损伤，从而稳定AS易损斑块。