三黄膏对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染大鼠皮下软组织炎症及TLR2/NF-κB信号通路的影响

潘海邦，王天明，崔岩，李晓丽，付琦，陈乾，吴国泰，王波

1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000；2.甘肃中医药大学第一临床医学院，甘肃 兰州 730000；3.甘肃中医药大学甘肃省中药药理与毒理学重点实验室，甘肃 兰州 730000；4.甘肃中医药大学护理学院，甘肃 兰州 730000

体表软组织感染是外科常见病，表现为由病原体入侵与繁殖所引起的炎症反应，其中以金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌最常见。细菌通过皮肤黏膜侵入机体，大量增殖并诱发机体局部产生炎症因子，激活相关细胞信号途径关键分子如Toll样受体（TLR）、核因子（NF）-κB等，诱导多种促炎因子和炎性介质释放，引起全身炎症反应。较为严重的皮下软组织感染不但引起炎症过度反应、局部红肿、溃脓创面、组织坏死，脓肿形成，还可通过血液扩散，导致肺部感染、肝脓肿等，甚至引发败血症或感染性休克而危及生命。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）是最常见的耐药金黄色葡萄球菌，在体表感染组织、分泌物、脓液中检出率较高，已成为临床严重创伤、术后、老年体弱、重症患者最主要的致死原因之一。据统计，全球每年至少有70万人死于耐药菌。

对于体表局部软组织感染的治疗，西医主要采用局部处理、热敷等，成脓后切开引流并给予抗生素治疗。但手术引流创伤大，愈合周期长，需长期换药，且抗生素滥用已成为重大用药安全隐患，使MRSA等耐药菌在临床感染中日益增多。三黄膏为甘肃中医药大学附属医院院内制剂（甘药准字Z04010878），具有清热解毒、活血消肿、托毒排脓等作用，对于疖、痈、丹毒、脓肿等感染疗效显著，但其作用机制尚不明确。本实验采用MRSA感染大鼠，观察三黄膏对感染组织炎症反应的影响，从TLR2/NF-κB通路探讨其抗炎机制。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级健康Wistar大鼠96只，雌雄各半，体质量（280±10）g，甘肃中医药大学医学实验中心提供，动物许可证号SCXK（甘）2015-0002。单笼饲养于甘肃中医药大学科研实验中心SPF级实验室。实验动物处理遵守动物伦理原则，本研究经甘肃中医药大学伦理委员会批准（2018-054）。

1.2 药物

三黄膏（黄芩、黄连、黄柏），甘肃中医药大学附属医院提供，批号210329；莫匹罗星软膏（百多邦），中美天津史克制药有限公司，批号3L4K。

1.3 主要试剂与仪器

MRSA（ATCC 25923），甘肃省人民医院临床医学转化中心馈赠；肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1β、IL-7 ELISA 试剂盒（货号分别为JL13202、JL20884、JL20897），上海将来实业股份有限公司；TLR2抗体、转化生长因子-β活化激酶结合蛋白1（TAB1）抗体、NF-κB 抗体（批号分别为GR3348211-1、GR3273233-1、GR32932611），美国GeneTex 公司；TRlzol（批号152104），美国Ambion公司；反转录试剂盒、RT-qPCR试剂盒（批号分别为AI40704A、AI61180A），日本TaKaRa公司；GAPDH抗 体 （批 号 B1501）， 美 国 ImmunoWay 公 司 。BIOMATE 3S核酸蛋白测定仪、CT14RD型高速低温离心机，上海天美生化仪器设备工程公司；Benchmark Plus酶标仪、ChemiDOC XRS+凝胶成像分析系统，美国Bio-Rad公司；SCIENTZ-48型高通量组织研磨器，宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.4 分组、造模及给药

96只大鼠适应性喂养1周后，按随机数字表法分为空白组、模型组、百多邦组和三黄膏高、中、低剂量组，每组16只。参考Malachowa等方法造模，每只大鼠背部近颈侧以脊柱为中线用签字笔标记2 cm×2 cm区域脱毛，除空白组外，其余各组大鼠皮下注射浓度为6×10CFU/mL的MRSA菌悬液1 mL，空白组不做任何处理，以脱毛区域出现脓性感染灶表现为造模成功。造模次日开始外敷给药，百多邦组按0.5 g/只涂抹百多邦（以凡士林调整药膏总量为1 g/只），相当于临床成人使用剂量的2倍；三黄膏高、中、低剂量组按1、0.5、0.25 g/只涂抹药膏（以凡士林调整药膏总量为1 g/只），相当于临床成人使用剂量的4、2、1倍；空白组和模型涂抹等量凡士林，每日2次，连续7 d。每日观察大鼠一般状况及软组织感染变化。

1.5 取材

干预结束后，10%水合氯醛腹腔注射（3 mL/kg）麻醉大鼠，心脏采血，分离大鼠皮下感染组织，使用预冷的生理盐水冲洗干净并分装于冻存管中，放入液氮中冻存备用。

1.6 HE染色

4%多聚甲醛固定感染组织，石蜡包埋，切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，苏木精染色，盐酸酒精分化，梯度乙醇脱水，伊红染色，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察。

1.7 ELISA检测

大鼠心脏采血后3 000 r/min离心15 min，吸取血清，按照ELISA试剂盒说明书操作，酶标仪波长450 nm处测定吸光度，绘制标准曲线，计算血清TNF-α、IL-1β、IL-7含量。

1.8 RT-qPCR检测

采用Trizol法提取总RNA，以RNA为模板反转录合成cDNA，根据RT-qPCR试剂盒说明书设置反应体系及参数，进行PCR。引物由宝生物工程（大连）有限公司合成，引物序列见表1。以β-actin 为内参，2法计算mRNA相对表达量。

表1 各基因PCR引物序列

1.9 Western blot检测

取适量感染组织剪碎，加入裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。蛋白上样后，依次进行电泳、转膜、封闭，滴加TLR2一抗（1∶1 000）、TAB1一抗（1∶1 000）、NF-κB p65一抗（1∶5 000）、GAPDH一抗（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，滴加二抗（1∶5 000），室温孵育1 h，TBST洗膜，ECL显影，凝胶成像分析系统成像，使用Quantity One软件进行分析。

1.10 统计学方法

2 结果

2.1 三黄膏对模型大鼠一般情况的影响

空白组大鼠精神状况良好，反应灵敏，进食正常，皮毛浓密且有光泽，大便成形、呈褐色；模型组大鼠造模后饮食减少，精神萎靡，皮毛色泽枯槁、易落；各给药组大鼠在药物干预后精神状态好转，饮食量恢复，毛色变光泽，大便成形，尤以三黄膏高剂量组较为明显。造模前后皮肤组织变化见图1。

图1 大鼠造模前后皮肤对比

2.2 三黄膏对模型大鼠感染组织病理变化的影响

空白组大鼠皮肤组织结构清晰。模型组大鼠感染组织表皮层鳞状上皮普遍增厚，脓肿区域表皮结构破坏、层次不清；真皮层变薄，染色加深，胶原纤维聚集成片状、团块状，各层有大量炎性细胞浸润；皮下组织结构减少。三黄膏高剂量组大鼠感染组织胶原纤维聚集明显减少，周围肉芽组织填充，有新生的薄壁毛细血管。三黄膏中剂量组大鼠感染组织损伤程度稍减轻，有少量肉芽组织及新生薄壁毛细血管。三黄膏低剂量组大鼠感染组织损伤程度较重，胶原纤维聚集成条索状，坏死层较三黄膏高剂量组增加，肉芽组织填充较三黄膏高剂量组减少。见图2。

图2 各组大鼠感染组织形态（HE染色，×40）

2.3 三黄膏对模型大鼠血清及感染组织肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-7含量的影响

与空白组比较，模型组大鼠血清及感染组织TNF-α、IL-1β、IL-7含量明显增加（＜0.01）；与模型组比较，三黄膏高剂量组大鼠血清及感染组织TNF-α、IL-1β、IL7-含量明显减少（＜0.05，＜0.01）。结果见表2。

表2 各组大鼠血清及感染组织TNF-α、IL-1β、IL-7含量比较（）

2.4 三黄膏对模型大鼠感染组织肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-7、Toll 样受体2、转化生长因子-β活化激酶结合蛋白1、核因子-κB p65 mRNA表达的影响

与空白组比较，模型组大鼠感染组织TNF-α、IL-1β、IL-7、TLR2、TAB1、NF-κB p65 mRNA 表达升高，差异有统计学意义（＜0.01）；与模型组比较，三黄膏高剂量组大鼠感染组织TNF-α、IL-1β、IL-7、TLR2、TAB1、NF-κB p65 mRNA表达降低，差异有统计学意义（＜0.05，＜0.01）。结果见表3。

表3 各组大鼠感染组织TNF-α、IL-1β、IL-7、TLR2、TAB1、NF-κB p65 mRNA表达比较（）

2.5 三黄膏对模型大鼠感染组织Toll 样受体2、转化生长因子-β活化激酶结合蛋白1、核因子-κB p65蛋白表达的影响

与空白组比较，模型组大鼠感染组织TLR2、TAB1、NF-κB p65蛋白表达明显升高（＜0.01）；与模型组比较，三黄膏高剂量组大鼠感染组织TLR2、TAB1、NF-κB p65蛋白表达明显降低（＜0.05，＜0.01）。见表4、图3。

图3 各组大鼠感染组织TLR2、TAB1、NF-κB p65蛋白免疫印迹

表4 各组大鼠感染组织TLR2、TAB1、NF-κB p65蛋白表达比较（）

3 讨论

研究表明，TLR信号通路持续激活诱发炎症因子“瀑布式”增加，进而导致炎症反应持续存在。TLR2通过与TLR1或TLR6形成异源二聚体来识别嵌入葡萄球菌细胞膜中的脂蛋白、脂磷壁酸和肽聚糖，CD14作为TLR2的共受体，能促进脂磷壁酸与质膜结合，增强NF-κB的活化。TAB1是一种与转化生长因子β激活激酶1（TAK1）的N端激酶结构域有关的接头蛋白，是TAK1 持续激活必需的结合蛋白。TLR2在病原微生物刺激后招募接头蛋白髓样分化初级反应蛋白88，随后启动细胞内信号转导，TAK1是TLR2/NF-κB信号通路的关键分子，与TAB1结合后使IκB激酶磷酸化，最终导致转录因子NF-κB核易位，促进下游炎症因子产生。哺乳动物NF-κB是由5个相关蛋白质组成的家族，其结合形成二聚体，包括p50和p65，p65包含主要的NF-κB转录活性，因此负责大量促炎症介质的表达，促进先天性免疫细胞白细胞招募。金黄色葡萄球菌的主要先天免疫刺激化合物是脂蛋白。研究显示，TLR2缺陷型巨噬细胞对金黄色葡萄球菌肽聚糖的反应受损，TLR2缺乏增加了宿主对葡萄球菌的易感性。TNF-α和IL-1β是TLR2/NF-κB信号通路下游的促炎性细胞因子，主要由淋巴细胞、巨噬细胞及单核细胞响应微生物诱导产生，并参与正常炎症反应和免疫反应。

三黄膏外敷治疗体表软组织感染疗效确切，但作用机制不明，限制其进一步开发应用。本研究通过MRSA感染大鼠模型，观察三黄膏外敷对感染软组织的影响，从病理变化、信号通路关键分子在血清和感染组织的表达方面探究三黄膏抗炎机制。结果显示，与空白组比较，模型组大鼠血清及感染组织TNF-α、IL-1β、IL-7含量显著增加，TLR2、TAB1、NF-κB p65蛋白及mRNA表达显著升高，提示皮下组织明显感染，炎症反应加重。与模型组比较，三黄膏外敷治疗后，大鼠一般状况及病理变化均明显改善，上述因子表达有不同程度降低，说明三黄膏外敷能减轻MRSA引起的大鼠皮下软组织炎症反应，可能通过抑制TLR2/NF-κB信号通路关键因子TLR2、TAB1、NF-κB p65等表达，从而减少下游TNF-α、IL-1β、IL-7等促炎因子释放，发挥抗炎作用。本研究可为三黄膏抗炎机制研究和进一步开发应用提供实验依据，也为中药治疗耐药菌感染提供新思路。