亚高山绣球菌多糖的提取优化、结构表征和抗炎作用

罗巅辉，张泽彤

华侨大学生物工程与技术系，厦门 361021

绣球菌属(Sparassis)物种肉质鲜嫩，是营养丰富的食用真菌。绣球菌属有10个小种[1]，目前关于绣球菌多糖的研究主要集中在两个种，分别是绣球菌(Sparassiscrispa)和广叶绣球菌(Sparassislatifolia)。绣球菌中多糖含量丰富，是其主要生物活性物质，研究表明绣球菌多糖具有抗肿瘤作用[2,3]，肠道免疫调节功能[4-6]和抗氧化作用[6,7]。多糖的结构是其发挥生物活性的基础，据报道S.crispa的主要多糖是有分支结构的β-(1→3)-D-葡聚糖，但其分子量(200 kDa)较大难溶于水[8,9]。S.latifolia中分离出的多糖主要由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖、和果糖构成，空间结构研究表明该多糖为网状结构，其化学结构不明确[6]。本课题以亚高山绣球菌(S.subalpina)为原料，详细表征其主要多糖的化学结构和空间结构，并对其抗炎活性进行研究，相较于绣球菌属其他小种，目前国内外未见相关报道。绣球菌野生资源稀缺，更多小种的研究能够帮助挖掘其应用潜力，以期更好地开发应用。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

亚高山绣球菌，云南野生采摘，由华侨大学生物学教研室鉴定为绣球菌属亚高山绣球菌(Sparassissubalpina)。所有试剂均为分析纯，主要试剂包括：葡聚糖标准品(美国Sigma公司，T10货号：D9260，T40货号：31389，T70货号：31390，T500货号：31392)； DEAE Sepharose-CL 6B(瑞士Pharmacia公司，货号：17-0710-01)；DMEM培养基(美国Hyclone公司，货号：SH30022.01B)；脂多糖(美国Sigma公司，货号：L2880)；胎牛血清(德国PAN-Biotech公司，货号：P40-37500)；总RNA提取试剂盒(美国Promega公司，货号：LS1040)；反转录试剂盒(美国Promega公司，货号：A5001)；qPCR Master Mix试剂盒(美国Promega公司，货号：A6001)。

主要仪器：MC 99-2自动蛋白分离层析仪(上海沪西仪器厂)；型号HP 1100高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；7890 B高效气相色谱仪(美国Agilent公司)；Forma 3111二氧化碳培养箱(美国Thermo公司)；CKX 41倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)；AVANCE-500 MHz核磁共振仪(德国Bruker公司)；H-7650透射电子显微镜(日本Hitachi High-Technologies公司)；4800 II实时荧光定量PCR系统(瑞士Roche公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 提取优化方法

单因素试验设计主要考察液料比、提取时间和提取温度对总糖提取率的影响[10]。液料比研究按质量比20∶1、50∶1、80∶1、120∶1和150∶1分别加入相应体积的蒸馏水，80 ℃水浴锅中水浴60 min。提取时间研究选取20、60、100、140和180 min为考察时间，液料比为50∶1，提取温度为80 ℃。提取温度研究选取30、50、65、80和100 ℃，液料比为50∶1，提取时间为60 min。每次实验称取干燥的亚高山绣球菌1 g，按照不同提取条件提取得到水溶性提取液，3 500 r/min离心10 min，取上清液进行苯酚-硫酸法检测，3次平行试验计算总糖提取率。

提取率=(W提取液糖含量/W样品质量)× 100%

根据单因素试验确定各因素试验水平，安排响应曲面试验。使用Design-Expert(Version 11，Stat-Ease Inc,USA)软件，Box-Behnken Design(BBD)设计法安排3因素3水平试验方案。以液料比(X1)，提取时间(X2)和提取温度(X3)为变量，总糖含量作为响应值，优化亚高山绣球菌总糖提取工艺条件[11]。

1.2.2 分离纯化方法

称取干燥的绣球菌100 g，按照“1.2.1”所得最佳提取条件提取得到粗提液，将粗提液用旋转蒸发仪浓缩40～50倍，加入4倍体积乙醇过夜，3 500 r/min离心10 min得沉淀，冷冻干燥后得粗多糖。取500 mg粗多糖配制成质量分数为2%～3%粗糖水溶液，使用Sevag法反复脱蛋白直至无固体蛋白层为止。将脱蛋白后的糖液上DEAE Sepharose-CL 6B柱(直径4.6 cm × 高36 cm)，上样量20 mL，流速为1 mL/min，12 min/管，使用0～1 mol/L NaCl进行洗脱，收集洗脱液，OD280下检测洗脱液的蛋白质分布，苯酚硫酸法检测洗脱液的糖分布。按照糖及蛋白质分布情况收集洗脱液，使用3 500截留分子量的透析袋蒸馏水透析48 h，浓缩透析液，冷冻干燥得到纯化的亚高山绣球菌多糖(Sparassissubalpinapolysaccharide，SSP)，按如下公式计算得率。

得率=(W纯化糖质量/W样品质量)× 100%

1.2.3 均一性及特性研究方法

采用高效凝胶排阻色谱法(HPSEC)鉴定SSP的均一性，色谱柱为日本昭和SUGAR KS-804柱，色谱柱温度是50 ℃，流动相为超纯水(流速1 mL/min)，检测器为示差折光检测器。重均分子量鉴定采用HPSEC方法，根据葡聚糖标准品(T10、T40、T70、T500)和葡萄糖的保留时间，以lgMw对Kav作图，绘制分子量标准曲线[12]。

采用苯酚-硫酸法[13]测定糖含量，紫外吸收光谱检测蛋白质及核酸，红外光谱法(FTIR)分析特征官能团[14]。单糖组成分析采用气相色谱法，取20 mg干燥多糖溶解于1 mol/L硫酸中，100 ℃水解8 h，水解液中加入碳酸钡中和至pH值中性，过滤后的滤液冷冻干燥得水解产物。将水解产物溶解于0.5 mL无水吡啶，加入2 mg甘露醇，70 ℃水浴30 min，冷却后加入0.2 mL六甲基二硅胺烷和0.1 mL三甲基氯硅烷进行衍生化。衍生产物用气相色谱法鉴定，色谱柱是HP-5毛细管色谱柱，柱温为程序升温，160 ℃升到180 ℃(20 ℃/min)，180 ℃升到220 ℃(8 ℃/min，保持2 min)，250 ℃(保持2 min)。检测器是氢火焰检测器，检测器温度为280 ℃[15]。为了研究多糖的热稳定性质，取干燥的多糖样品放入70 μL氧化铝坩埚中，氮气作为载气，以10 K/min的升温速度，在50～600 ℃内使用同步热分析仪检测。

1.2.4 化学结构和微观结构分析方法

化学结构研究采用核磁共振，20 mg纯化后的干燥多糖溶于2 mL重水，搅拌使其充分溶解后冷冻干燥，如此反复重复3次，检测前将其溶解于1 mL重水，转入核磁管进行NMR分析。使用 500 MHz核磁共振仪，使用标准Bruker程序，试验包括氢谱(1H NMR)、碳谱(13C NMR)、异核单量子相干谱(HSQC)、同核化学位移相关谱(1H-1H COSY)、全相关谱(TOCSY)和二维NOE谱(NOESY)。

使用扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)观察多糖微观结构。SEM制样在金属桩，表面镀铂。TEM观察，将样品配制成1 mg/mL溶液，加入等质量比的1 mg/mL SDS溶液，80 ℃水浴2 h后稀释至5 μg/mL，继续水浴2 h，滴加1滴样品液到200目铜网碳膜上，室温干燥，80 kV电压下观察。

1.2.5 抗炎试验方法

抗炎实验主要包括RAW 264.7细胞培养，总RNA的提取，反转录cDNA和实时荧光定量PCR检测(RT-qPCR)，包含空白组，阴性对照组(添加1 μg/mL脂多糖)，阳性对照组(添加1 μg/mL脂多糖和75 μg/mL地塞米松)和样品组(添加1 μg/mL脂多糖和不同浓度多糖SSP)。

RAW 264.7细胞的培养使用DMEM培养基(含10%血清和1%双抗)，37 ℃，5%二氧化碳培养箱培养48 h。总RNA的提取和反转录cDNA均采用试剂盒方法，反转录程序为42 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min。RT-qPCR检测采用SYBR Green染料法，按照试剂盒说明书操作，反应体系包括2 × Mix，上下游引物[16]和cDNA，共进行45个循环，扩增条件为95 ℃(15 s)→ 60 ℃(30 s)→ 72 ℃(30 s)。每个实验包括3个平行样，以GAPDH为内参基因，按照2-ΔΔCT法计算各炎症因子mRNA的相对表达量[15,16]。

2 结果与分析

2.1 亚高山绣球菌总糖提取优化

2.1.1 单因素试验结果

各单因素对亚高山绣球菌总糖提取率的影响如图1所示。在固定两个因素条件下，只考察一个因素对提取率的影响。随液料比增加提取率增大，当液料比达到50∶1时提取率最大，随后陡然下降。随提取时间的改变，总糖提取率呈现逐渐上升趋势，提取时间100 min时提取率最高，随后降低，整体趋势变化较小。随提取温度升高提取率逐渐增加，提取温度达到50 ℃以上，提取率相差幅度在4%以内，变化不明显。为保证原材料中的总糖能够充分提取出来，不造成多糖的断裂而降低其生物活性，同时减少操作工作量，选用液料比20∶1、50∶1、80∶1，提取时间60、100、140 min，提取温度65、80、95 ℃作为后续优化工艺试验条件。

图1 液料比(A)、提取时间(B)和提取温度(C)对亚高山绣球菌总糖提取率的影响Fig.1 Effects of liquid∶solid (A),extraction time (B) and extraction temperature (C) on the yields of total sugar from S.subalpina

2.1.2 响应面试验结果

响应面试验采用Design-Expert软件设计，BBD试验设计和结果见表1。试验所用3个因素的试验水平根据单因素结果选取，具体如下，液料比(X1)为20∶1、50∶1和80∶1，提取时间(X2)为60、100、140 min，提取温度(X3)为65、80、95 ℃。

用Design-Expert软件进行分析，得到回归方程如下：Y=14.84+2.29X1+0.14X2-0.59X3-2.54X1X2-0.10X1X3+0.80X2X3-1.52X12+0.01X22-1.08X32。模型的P值为0.001 6，相关系数R2= 0.91，校正决定系数R2(0.80)与预测R2(0.66)相差小于0.2，说明实测值与该模型预测值具有很好的拟合度，模型符合统计学意义。模型失拟项为0.86(> 0.05)，进一步说明拟合模型误差与纯误差相比不显著，在试验变量范围内，回归模型预测结果可靠。在模型预测的最优提取条件下(X1= 80 mL/g，X2= 60 min，X3= 70 ℃)，亚高山绣球菌总糖提取率的预测值18.54%和实际试验值(18.21 ± 0.68)%相差不显著，该模型可以很好地用于亚高山绣球菌总糖的提取工艺。根据模型的回归系数显著性检验结果，液料比对亚高山绣球菌总糖的提取率影响最显著(P= 0.000 7)，与单因素试验结果吻合，因此，在实际提取工艺中应着重注意对液料比的选取。

2.2 多糖SSP的纯化与特性分析

按照响应面试验得出的最佳提取工艺提取得到粗提液，对所得粗提液进行浓缩、醇沉后冷冻干燥，得到粗多糖，得率为25.60%。将粗多糖经Sevag法脱蛋白，脱蛋白后的糖液经DEAE Sepharose CL-6B柱层析纯化，苯酚-硫酸法(OD490)检测糖分布，OD280下检测蛋白质分布，结果如图2A。

图2 SSP的DEAE-Sepharose CL-6B层析图(A)和高效凝胶排阻色谱图(B)Fig.2 DEAE-Sepharose CL-6B chromatogram (A) and HPSEC profile (B) of SSP

在50～70管之间有一个较大的糖洗脱峰，且与蛋白质洗脱峰不重叠，收集该部分洗脱液，用截留分子量3 500的透析袋透析，透析液浓缩后冷冻干燥得到SSP，得率为10.50%。SSP的均一性鉴定采用高效凝胶排阻色谱法，结果如图2B所示，图中只有一个对称峰，说明SSP的均一性好。

参照葡萄糖标准曲线y=0.014x-0.006(R2=0.999)，测得SSP的糖含量为99.30%。紫外吸收光谱显示SSP不含有核酸及蛋白质等杂质。

SSP的FTIR结果如图3A所示，在3 424 cm-1(O-H伸缩振动峰)，2 926 cm-1(C-H特征吸收峰)，1 640 cm-1(C=O伸缩振动峰)，1 408 cm-1(C-H变角振动峰)和1 000～1 200 cm-1(C-O伸缩振动峰)均出现糖类物质的特征吸收峰，表明SSP为糖类化合物。

SSP的热重分析曲线(TG)及一阶微商曲线(DTG)如图3B所示。在65～116 ℃之间出现第一个失重台阶，此部分失重主要是样品吸附水的蒸发。第二个较大失重台阶出现在258～408 ℃范围内，SSP在这个温度范围内结构发生了剧烈的分解。SSP的热重分析只出现1个大的失重，也进一步验证了SSP物质成分单一，纯度较好。

根据标准葡聚糖的HPSEC保留时间，计算得到回归方程为y=-3.92x+6.31(R2= 0.990，图2B)，将SSP在HPSEC试验中的保留时间7.47 min代入方程，计算得出SSP的重均分子质量(Mw)为50 kDa。

图3 SSP的红外光谱图(A)、热重分析图(B)和气相色谱图(C)Fig.3 FTIR spectrum (A),thermal decomposition analysis curves (B) and GC profiles of SSP (C)注：*内标甘露醇；1～4分别代表葡萄糖、半乳糖、甘露糖和阿拉伯糖的衍生物。Note:*Mannitol;1-4 refer to derivatives of glucose,galactose,mannose and arabinose.

将完全水解后的多糖SSP衍生化，衍生产物用GC法检测，结果如图3C所示。对照标准单糖衍生化后的GC图3C，可以得出SSP由葡萄糖，甘露糖，半乳糖和阿拉伯糖组成，各单糖摩尔质量比为6.5∶1.3∶1∶1。

2.3 SSP的结构表征

SSP的1 D和2 D NMR结果如图4所示。根据1H NMR、13C NMR和HSQC，检测出4个异头质子，化学位移是δ4.58(1H，d，J= 7.9 Hz)、4.86(1H，s)、4.99(1H，s)和5.24 ppm(1H，s)，对应13C NMR的化学位移分别是103.10、102.01、103.10和101.73 ppm。按照异头质子化学位移从高场到低场，依次将其命名为糖残基A～D，各糖残基的摩尔比为6∶1.2∶1∶1，与单糖组成结果相吻合。从异头质子出发，通过COSY和TOCSY谱得到糖残基中氢的化学位移，根据氢的化学位移通过HSQC谱得出相对应的13C NMR化学位移，糖残基A～D的1H NMR和13C NMR化学位移如表2所示。

图4 SSP的1H NMR(A)、13C NMR(B)、HSQC(C)、COSY(D)、TOCSY(E)和NOESY谱(F) Fig.4 1H NMR (A),13C NMR (B),HSQC (C),COSY (D),TOCSY (E) and NOESY (F) spectra of SSP

表2 SSP的1H NMR和13C NMR数据

SSP的单糖组成分析显示葡萄糖占比最多，NMR显示糖残基A摩尔比例最高，且H2化学位移在高场区，说明A是葡萄糖构型。糖残基A的H1在4.4～4.8 ppm之间，且JH1,H2(7.9 Hz)在6～8之间，说明糖残基A为β构型。糖残基C的异头氢小于5.4 ppm，JH1,H2< 2 Hz，C4在82～84 ppm，说明糖残基C是呋喃阿拉伯糖，异头碳在103 ppm，进一步说明其为β构型。糖残基D 在COSY谱中只有H1～H3的化学位移，其他质子化学位移由TOCSY谱获得，其异头质子化学位移(5.4 ppm)大于5.0 ppm，JH1,H2< 3 Hz，说明糖残基D是α-半乳糖构型。根据糖残基B的13 C化学位移，其为甘露糖，由于JH1,H2很小，无法判断构型，但其NOESY谱中H1和H2有交叉峰，说明为α构型。根据表2中13C NMR化学位移，对照标准化学位移表，13C NMR化学位移向低场区有较大迁移，则该位置发生取代。糖残基A～D分别是→2)-β-D-Glup-(1→，→3)-α-D-Manp-(1→，→3)-β-L-Araf-(1→ 和 →3)-α-D-Galp-(1→。

NOESY谱中观察到糖残基D的H1与糖残基A的H2有NOE效应，说明糖残基D与糖残基A相连接，即→3)-α-D-Galp-(1→2)-β-D-Glup-(1→。糖残基C的H1与糖残基B的H3有NOE效应，说明糖残基C与糖残基B相连接，即→3)-β-L-Araf-(1→3)-α-D-Manp-(1→。综上所述，SSP的重复结构单位是→3)-α-D-Galp-(1→2)-β-D-Glup-(1→3)-β-L-Araf-(1→3)-α-D-Manp-(1→。

采用SEM和TEM观察SSP的微观结构，结果见图5。SEM 显示SSP是片状结构，表面无孔，说明没有分支结构。高放大倍数SEM下可见SSP表面粗糙，说明糖链之间互相交叠或缠绕，且凸起呈网状交织样。TEM 显示SSP无分支，为多个糖链相互交织在一起的网状结构，与上述NMR和SEM分析的结构吻合。

图5 SSP的扫描电镜图(A～C，500～10 000×)和透射电镜图(D,5 000×)Fig.5 SEM (A-C,500-10 000×) and TEM images (D,5 000×) of SSP

2.4 SSP的抗炎症作用

为了选择安全无毒的SSP添加量，首先对SSP进行细胞毒研究，试验结果如图6A。显著性分析结果表明，添加25或75 μg/mL的SSP对RAW 264.7细胞增长没有细胞毒性，因此选择这两个浓度进行抗炎症试验。对各组细胞提取总RNA，反转录得到cDNA，采用相应的引物进行RT-qPCR。RT-qPCR结果显示扩增曲线均呈现S型，说明所得CT值可信度高，熔解曲线均呈现单一对称峰，进一步说明引物特异性高，获得目标扩增基因。根据所得CT值，采用2-ΔΔCT法计算各mRNA相对内参基因GAPDH的表达量，结果如图6所示。为了诱导RAW 264.7细胞产生炎症模型，阴性组添加了LPS，相较于空白组，阴性组TNF-α、COX-2和iNOS的mRNA表达量都极显著增加(P<0.001)，说明炎症模型构建成功。

图6 SSP对RAW 264.7的细胞毒作用(A)以及对TNF-α(B)、COX-2(C)和iNOS(D)mRNA表达的影响Fig.6 Cytotoxicity of SSP on RAW 264.7 cells (A),and effects on TNF-α (B),COX-2 (C) and iNOS (D) mRNA expression注：与空白组比较，#P < 0.05；不同小写字母表示差异显著，P < 0.05。Note:Compared with control,#P < 0.05;Different lowercase letter refer to significant differences(P < 0.05).

RAW 264.7细胞中添加LPS后，添加地塞米松作为阳性对照组，不同浓度SSP作为两个样品组。从图6可以看出，与阴性组相比，阳性对照组和两个样品组的TNF-α、COX-2和iNOS表达量均显著降低(P<0.05)，说明均具有抗炎症作用。两个不同浓度样品组对TNF-α、COX-2和iNOS基因表达影响差异不显著(P>0.05)，说明SSP的抗炎症作用并不呈现剂量效应。在25或75 μg/mL不同质量浓度下，SSP对TNF-α表达的抑制率分别是69.0%和78.2%，对COX-2表达抑制率分别是41.4%和43.5%，对iNOS基因表达抑制率分别是43.5%和47.7%。显著性分析结果显示，SSP对TNF-α和iNOS表达抑制作用与阳性对照组无显著差异(P>0.05)，说明SSP的部分抗炎症作用与地塞米松相当。

3 结论

获得亚高山绣球菌总糖提取工艺模型Y=14.84+2.29X1+0.14X2-0.59X3-2.54X1X2-0.10X1X3+0.80X2X3-1.52X12+0.01X22-1.08X32，得到最佳提取条件(液料比=80 mL/g，提取时间=60 min，提取温度=70 ℃)，该条件下提取率为(18.21 ± 0.68)%。从亚高山绣球菌中分离纯化得到1个水溶性多糖SSP，得率为10.50%。SSP组分均一，含有糖类物质的特征官能团，糖含量为99.30%，不含有蛋白质和核酸，在258～408 ℃范围内发生物质分解，重均分子质量是50 kDa，由葡萄糖，甘露糖，半乳糖和阿拉伯糖组成，各单糖摩尔质量比为6.5∶1.3∶1∶1。SSP是无分支结构的多糖，其化学结构的重复单位是→3)-α-D-Galp-(1→2)-β-D-Glup-(1→3)-β-L-Araf-(1→3)-α-D-Manp-(1→，空间结构表现为多糖链交织的网状结构。成功建立炎症模型，25或75 μg/mL多糖SSP对炎症细胞RAW 264.7中TNF-α、COX-2和iNOS的表达均有显著抑制作用(P<0.05)，且SSP对TNF-α和iNOS表达抑制作用与阳性对照组无差异(P>0.05)。

据报道，脑出血病人和阿尔茨海默病(AD)患者体内趋化因子(TNF-α)含量明显增多[17]，TNF-α能增加斑块沉积，具有神经毒性，会进一步激活iNOS基因过表达，从而造成神经元细胞损伤和凋亡[18]。亚高山绣球菌多糖能有效抑制TNF-α和iNOS的过量表达，作为结构明确的天然食用菌，对中枢系统疾病具有良好的保健作用。