miR-328-5p对乳腺癌细胞的调控机制研究

孙静宜，李建梅，马英桥，赵 月

微小RNA(miR)是一类高度保守的单链非编码小RNA，可作为致癌基因和抑癌基因在肿瘤发生、发展中起重要调控作用，被认为是潜在的肿瘤标志物和治疗靶点[1-2]。研究发现长链非编码RNA或环状RNA通过调控miR-328-5p表达参与非小细胞肺癌等多种肿瘤的发生发展，有潜力成为多种恶性肿瘤的诊断标志物[3]。多项研究表明，多个异常高活性信号通路已被证实能阻止肿瘤细胞失巢凋亡，其中异常高活化整合素在人类肝癌细胞转移期发挥重大作用[4-5]。但关于miR-328-5p、整合素与乳腺癌发生、进展的关系及具体机制尚未明确[6]。本文分析miR-328-5p对乳腺癌细胞增殖、凋亡的影响，并进一步探讨miR-328-5p与整合素α5(ITGA5)的关系及其调控PI3K/AKT信号通路的具体机制。

1 材料与方法

1.1材料与仪器 乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231及正常乳腺上皮细胞系MCF10A，购自美国ATCC细胞库。胎牛血清及RPMI1640培养基购自美国Gibco公司，CCK-8试剂盒购自上海碧云天公司，LipofectamineTM2000转染试剂盒购自美国Invitrogen公司，Matri-gel基质胶及细胞培养板购自美国BD公司。miR-328-5p mimic和miR-NC购自上海美轩生物科技有限公司，兔抗人ITGA5多克隆抗体购自博奥派克生物有限公司，兔抗人ITGA5单克隆抗体购自美国Abcam公司。PCR仪、化学发光仪凝胶成像系统、流式细胞仪及透射电镜购自美国BD公司。

1.2研究方法

1.2.1细胞培养：乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231及正常乳腺上皮细胞系MCF10A用含10%胎牛血清RPMI1640培养基培养，培养基中加入双抗青霉素-链霉素，后置于37 ℃、5% CO2培养箱中恒温培养。

1.2.2细胞转染：取生长状态良好的乳腺癌细胞MCF-7，据不同转染方法分为Control组(空白对照)、miR-NC组(转染阴性对照miR-NC)、miR-328-5p mimic组(转染miR-328-5p mimic)及miR-328-5p mimic+ITGA5组。ITGA5按照LipofectamineTM2000说明书瞬时转染。转染6 h后换液，继续培养用于后续实验。

1.2.3miR-328-5p、ITGA5检测：使用miRNA提取试剂盒从细胞中提取RNA，用逆转录试剂盒行逆转录和RT-PCR。计算机系统自动分析各样本Ct值，采用2-ΔΔCt法计算miRNA相对表达量。

1.2.4miR-328-5p与ITGA5的靶向关系：通过TargetScan法[7]及荧光素酶报告基因检测观察miR-328-5p与ITGA5的靶向关系。

1.2.5细胞增殖：采用CCK-8法[8]检测细胞增殖能力。将处于对数生长期的MCF-7细胞铺于96孔板中，3000个/孔行转染培养。每组重复3次，培养48 h，加入CCK-8试剂10 μl室温孵育4 h，酶标仪测定吸光度值。

1.2.6细胞凋亡：应用流式细胞仪[9]检测乳腺癌MCF-7细胞凋亡情况。细胞经转染处理后，胰酶消化收集细胞，PBS液洗涤，加入Annexin V-FITC和PI试剂各5 μl室温避光孵育30 min，通过流式细胞仪采用Annexin-FITC/PI双染法流式细胞术检测MCF-7细胞凋亡情况。

1.2.7ITGA5及PI3K/AKT通路蛋白表达：采用Western blot法[10]检测ITGA5及PI3K/AKT通路蛋白表达，根据目的蛋白和内参灰度值之比分析ITGA5、PI3K、AKT、p-PI3K和p-AKT蛋白表达。

2 结果

2.1不同乳腺癌细胞系miR-328-5p、ITGA5 mRNA比较 乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231中miR-328-5p mRNA含量显著低于正常乳腺上皮细胞系MCF10A，而ITGA5 mRNA含量显著高于正常乳腺上皮细胞系MCF10A(P<0.05)，见图1。

图1 不同乳腺癌系细胞miR-328-5p、ITGA5 mRNA含量比较ITGA5为整合素α5；与MCF10A细胞比较，①P<0.05

2.2miR-328-5p与ITGA5的靶向关系 miR-328-5p mimic组miR-328-5p mRNA含量显著高于Control组和miR-NC组(P<0.05)；miR-328-5p转染后ITGA5荧光素酶活性显著下调(P<0.05)。见图2。

图2 miR-328-5p与ITGA5的靶向关系ITGA5为整合素α5；与Control组、miR-NC组或wt-ITGA5比较，①P<0.05

2.3不同转染组MCF-7细胞ITGA5 mRNA含量比较 miR-328-5p、ITGA5转染后，miR-328-5p mimic组ITGA5 mRNA含量显著低于Control组、miR-NC组及miR-328-5p mimic+ITGA5组(P<0.05)。见图3。

图3 不同转染组MCF-7细胞ITGA5 mRNA含量

2.4不同转染组MCF-7细胞增殖情况 miR-328-5p mimic组MCF-7细胞增殖率显著低于Control组、miR-NC组及miR-328-5p mimic+ITGA5组(P<0.05)。见图4。

2.5不同转染组MCF-7细胞凋亡情况 miR-328-5p mimic组MCF-7细胞凋亡率显著高于Control组、miR-NC组及miR-328-5p mimic+ITGA5组(P<0.05)；与Control组比较，miR-328-5p mimic组细胞凋亡率显著升高(P<0.05)；与miR-328-5p mimic组比较，miR-328-5p mimic+ITGA5组细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。见图5。

图5 不同转染组MCF-7细胞凋亡率比较

2.6不同转染组MCF-7细胞ITGA5蛋白及PI3K/AKT通路蛋白比较 与Control组比较，miR-NC组ITGA5、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)，miR-328-5p mimic组ITGA5、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表达显著降低(P<0.05);与miR-328-5p mimic组比较，miR-328-5p mimic+ITGA5组ITGA5、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表达显著升高(P<0.05)。见图6。

图6 不同转染组MCF-7细胞ITGA5、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表达比较

3 讨论

随访调查显示：大多数早中期乳腺癌患者5年内预后较好，而侵袭和转移是乳腺癌预后不良的主要因素[11-13]，但目前临床对乳腺癌侵袭、转移的具体分子机制尚不完全清楚[14]。研究显示，在乳腺癌的发生及病情进展中，miR可能起着关键作用[15-16]。且miR参与乳腺癌发生、进展的机制可能为干扰肿瘤抑制因子和促进癌基因表达[17]。

长链非编码RNA TPTEP1竞争性抑制miR-328-5p，从而抑制非小细胞肺癌细胞增殖。乳腺癌组织miR-328-5p可通过靶向糖基化终产物受体抑制MDA-MB-231细胞增殖，但具体作用机制还有待进一步研究。本研究发现，miR-328-5p在MCF-7细胞内表达最低，故以MCF-7细胞作为后续实验对象；进一步实验发现：miR-328-5p转染后，miR-328-5p mimic组miR-328-5p mRNA含量显著高于miR-NC组与Control组，而细胞增殖率与凋亡率则分别低于、高于miR-NC组、Control组，提示miR-328-5p可抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖，促进其凋亡。且miR-328-5p转染后，miR-328-5p mimic组ITGA5 mRNA含量显著降低，ITGA5荧光素酶活性显著下调，认为miR-328-5p可靶向作用ITGA5。大部分整合素已被明确是重要的卵巢癌转移介质，且关系最为紧密的为ITGA5[18]。大量研究显示，整合素异常高活化在肿瘤转移中发挥重要作用，并可介导细胞间黏附，推动肿瘤细胞迁移[19-20]。本实验数据显示：乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231中ITGA5 mRNA含量显著高于正常乳腺上皮细胞系MCF10A；且经miR-328-5p转染后，miR-328-5p mimic组ITGA5 mRNA含量显著降低，miR-328-5p mimic组细胞增殖率、凋亡率显著低于、高于miR-NC组、Control组及miR-328-5p mimic+ITGA5组，提示敲除ITGA5基因可使得乳腺癌细胞增殖减少。曾有研究证实，PI3K/AKT信号通路失衡严重影响多种肿瘤的发生、进展及治疗耐药性，在细胞增殖、凋亡中起着至为关键的作用[21-22]。

AKT蛋白处于PI3K/AKT信号通路的中心位置，经磷酸化后被激活形成p-AKT，后者进一步使多个AKT下游蛋白发生磷酸化，从而调控肿瘤细胞增殖与凋亡[23-24]。刘洋等[25]分别检测正常乳腺上皮细胞系MCF10A和乳腺癌细胞PI3K、AKT表达，发现正常乳腺组织PI3K、AKT蛋白与mRNA表达明显高于乳腺癌细胞，推测PI3K/AKT信号通路与乳腺癌进展密切相关。本研究Western blot法检测结果证实miR-328-5p可抑制PI3K/AKT信号通路，从而抑制乳腺癌细胞增殖、诱导其凋亡。

综上，miR-328-5p可抑制乳腺癌细胞MCF-7增殖，促进细胞凋亡，作用机制可能与靶向作用ITGA5下调PI3K/AKT信号通路有关。