深圳市育龄女性FMR1基因CGG重复序列的多态性分析

谢海珊，程丽琴,王庆红，韦瑞红，周 瑾

脆性X智力低下1(FMR1)基因位于X染色体Xq27.3处，其5' 末端非编码区含有高度多态性FMR1基因(CGG)三核苷酸短串联重复序列，上游启动子区存在一个CpG岛[1]。FMR1基因全突变可致脆性X综合征(FXS)，临床常有典型的遗传性智力低下或自闭症等表现，对患者生活质量造成不利影响。研究表明，在同一种族和民族群体中，FMR1等位基因的CGG重复大小在两性中分布相似，但不同群体中FMR1等位基因的携带率存在差异[2]。目前，我国尚缺乏多中心、大范围FMR1基因筛查研究。故加强不同地区FMR1基因突变携带者筛查，不仅可为我国人群FMR1基因分布情况提供理论依据，而且对预防FXS患儿的出生具有重要意义。本研究主要通过对深圳市育龄女性进行FMR1基因筛查，获得本市育龄女性FMR1基因分布情况，以期为本市FXS预警、产前筛查和遗传咨询提供理论基础。

1 对象与方法

1.1研究对象 募集2020年12月—2021年9月在我院门诊就诊或住院的育龄女性中具有不明原因自然流产、稽留流产、复发性流产(孕20周内流产≥2次)、原发不孕、因胎儿畸形或死胎引产、有不明原因的智力发育迟缓等不良生育史患者，以及具有抑郁症、精神分裂症等精神疾病和不明原因的卵巢功能不全或卵巢早衰或自愿参加FMR1基因检测的育龄女性。共有100名育龄女性参加本研究，年龄18～47(30.85±4.86)岁。

1.2研究方法

1.2.1标本采集:所有研究对象抽取外周静脉血2 ml于EDTA-K2抗凝管中，2～4 ℃冰箱保存待测。

1.2.2DNA提取:依次将20 μl蛋白酶K、200 μl全血样本及200 μl Buffer AL加入1.5 ml离心管中，振荡混匀、短暂离心后56 ℃孵育15 min,短暂离心，加入200 μl无水乙醇、振荡混匀并短暂离心，将所得混合液移入QIAamp离心柱中并套进2 ml收集管中，8000 r/min离心1 min，弃去收集管及其中滤液，将离心柱套进新的2 ml收集管中，分别加入500 μl AW1、500 μl AW2并重复8000 r/min离心1 min、弃废液，后12 000 r/min离心2 min，将离心柱置于新的1.5 ml收集管中，打开盖子室温下晾干3 min，使乙醇挥发干净，将100 μl Buffer AE加入离心柱，室温孵育5 min后12 000 r/min离心2 min，对核酸样本进行洗脱，最后弃离心柱，保存洗脱液备用。

1.2.3PCR扩增:将除Taq DNA聚合酶外的所有试剂于室温下解冻后涡旋，受检样本和对照样本PCR反应体系总体积均为25 μl，包括8.5 μl甜菜碱、1 μl 4%二甲亚砜，2.5 μl PCR Buffer Ⅱ、3 μl dNTPs、0.75 μl FAM标记正向引物、0.75 μl反向引物、0.75 μl CGG引物、0.225 μl DNA聚合酶、2 μl受检样本/对照样本,双蒸水补足至25 μl。充分混匀、密封，再次涡旋、短暂离心后转到PCR扩增仪中。PCR反应条件：98 ℃预变性10 min后进行10个循环：97 ℃ 35 s，62 ℃ 35 s， 68 ℃ 4 min，接着行25个循环：97 ℃ 35 s，62 ℃ 35 s，68 ℃ 4 min且每个循环增加20 s，然后68 ℃延伸10 min后迅速转至4 ℃环境中。

1.2.4毛细管电泳:室温解冻甲酰胺(HiDi)、LIZ1200，振荡涡旋、短暂离心，取5 μl HiDi与0.2 μl LIZ1200混匀备用，后取5 μl混合物与0.5 μl PCR反应产物有序加入96孔板，封膜、短暂离心后转至PCR扩增仪中，95 ℃ 2 min变性后于4 ℃环境避光保存。使用美国ABI 3730xl基因测序仪对PCR产物行毛细管电泳，最后用Gene Marker V1.91软件实现CGG重复次数与长度的转换。

1.2.5判断标准：CGG重复数在6～44次为正常型，45～54次为中间型或灰色区域，55～200次为前突变，>200次为全突变。在同一个体中，将FMR1 2个等位基因中CGG重复次数少者称为等位基因1，CGG重复次数多者称为等位基因2，CGG重复数<26定义为低正常范围等位基因，>34定义为高正常范围等位基因[3-4]。

1.3统计学方法 应用SPSS 25.0软件处理数据。计数资料以率(%)表示，比较采用χ2检验或Fisher精确检验。α=0.05为检验水准。

2 结果

2.13组等位基因分布 100名育龄女性中78名具有不良生育史，根据不良生育史分为自然流产组(15名)、复发性流产组(42名)和其他异常生育史组(21名)。3组2个FMR1等位基因中最常见CGG重复数为29和30(图1)，将3组CGG重复序列变异范围分为连续的3组，等位基因1自然流产组≤25及≥35 0例，26～34 15例；复发性流产组≤25及≥35各1例，26～34 40例；其他异常生育史组≤25 1例，26～34 20例，≥35 0例。等位基因2自然流产组≤25 0例，26～34 12例，≥35 3例；复发性流产组≤25 0例，26～34 25例，≥35 17例；其他异常生育史组≤25 0例，26～34 17例，≥35 4例。3组间FMR1等位基因1及等位基因2 CGG重复序列分布情况比较差异无统计学意义(P>0.05)。

图1 3组育龄女性FMR1等位基因1和2 CGG重复序列分布A.FMR1等位基因1，B.FMR1等位基因2；FMR1为脆性X智力低下1

2.2100名育龄女性FMR1等位基因重复序列分布 100名育龄女性共检出15种不同CGG重复序列等位基因，CGG重复数范围为21～44，最常见重复数为30，其次为29、31、36。其中最常见基因型为30/30、其次为29/29。100名育龄女性FMR1等位基因CGG重复序列分布见图2。

图2 100名育龄女性FMR1等位基因CGG重复序列分布FMR1为脆性X智力低下1

3 讨论

FXS是一种X连锁显性遗传病，为常见致遗传性智力障碍的原因，发病率仅次于唐氏综合征[5-6]，发病机制为FMR1基因5' 非翻译区CGG重复序列的异常扩增和CGG重复序列及启动子区CpG岛的高度甲基化导致基因转录抑制，引起编码蛋白脆性X智力低下蛋白缺失而致病，另有1%～2%的FXS病例是由FMR1基因点突变、无义突变或缺失引起的。携带FMR1全突变基因的男性患者会受到FXS影响，而女性患者因2条X染色体随机失活，只有30%～50%的全突变等位基因携带者受到FXS影响[7]。约20%携带FMR1前突变等位基因的女性患有FXPOI，且患病率随着CGG重复序列长度的扩增而变化，最常见的CGG重复数为80～100。约40%携带FMR1前突变基因的男性有患FXTAS的风险，但约16%的FMR1前突变等位基因的女性携带者有患FXTAS的风险。前突变等位基因高度不稳定，可能在1代传递过程中就扩增到更高的CGG重复大小甚至全突变，而这通常发生在母系传递的过程中[3]。目前对于灰区的临床意义尚无统一结论，虽然灰区不会引起FXS，但是约有4.7%的灰区等位基因不稳定，在母系传递过程中可能扩增到前突变等位基因范围[8]。正常等位基因很少有减数分裂或有丝分裂不稳定，可稳定行代际传递[9]。

美国妇产科医师学会建议对有脆性X相关疾病家族史或可能有FXS相关智力障碍的计划妊娠或孕期女性进行FMR1前突变等位基因筛查[10]。据估计，美国和英国FXS患者终身护理成本分别为615 397美元和380 000英镑[11-12]。我国台湾地区每进行一次FXS基因检测约需125美元，每鉴定一位女性前突变或全突变基因携带者约需118 885美元，每鉴定出一个全突变基因胎儿的总费用约为410 091美元[13]。故对育龄女性行FXS携带者筛查可能是可取的。

本研究发现3组FMR1等位基因1和等位基因2 CGG重复序列分布差异均无统计学意义，且未发现FMR1突变基因携带者。而我国前期研究报道，具有不良生育史女性的前突变基因携带率为1/72～1/369[14-15]，表明在具有不良生育史的女性中，可能具有相对较高的携带前突变等位基因风险，在此类人群中行FMR1基因筛查，有助于生育指导。本研究发现FMR1基因CGG重复序列变异范围呈“双峰分布”现象，主峰CGG重复次数为29～30，“次峰”CGG重复次数为36，与前期国内报道结果基本一致[16]，也与亚洲人群CGG重复数分布情况基本相似[17]，但与非洲人和白种人相比，亚洲人群FMR1等位基因CGG重复次数<26的比例显著偏低，且亚洲人群比白种人具有更高比例(26～32次)CGG重复数的FMR1等位基因携带率，表明FMR1基因CGG重复数的分布存在地区、种族差异[18]。

BARTHOLOMAY等[19]汇总了前期研究结果，指出男性FXS患病率为1︰2500～1︰7000，女性FXS患病率为1︰2500～1︰11 000。但不同地区、不同种族FXS发病率存在差异，此外因女性前突变等位基因携带者有生育FXS后代的风险，故FMR1前突变基因携带者的筛查尤其重要。近年我国一些地区已开展FMR1基因相关研究，结果显示我国女性前突变等位基因携带率为1/410～1/772[20-21]。本研究结果显示，深圳市100名育龄女性FMR1基因筛查未发现前突变或全突变基因携带者，低于我国其他地区女性前突变基因携带率。对比国外研究，我国女性前突变基因携带率高于日本和韩国，但差异无统计学意义[22-23]，而以色列女性前突变基因携带率高达1/157，显著高于东亚国家[24]，造成此差异的原因可能是以色列主要人口为具有较高前突变基因携带率的犹太民族[25]。我国与加拿大、美国亚裔女性的前突变基因携带率相近，但低于美国白种女性[25-26]，表明不同地区、种族中女性FMR1前突变基因携带率存在一定差异，但同一种族在不同地区的携带率无差异。

综上，不同地区、种族女性FMR1前突变基因携带率存在一定差异，但同一种族在不同地区携带率无差异。本研究为进一步大规模全国性研究及亚洲不同地区筛查研究提供了理论依据，有助于育龄女性的筛查及高危人群的生育指导。