长链非编码RNA-肺腺癌转移相关转录因子1联合胃蛋白酶原对早期胃癌的诊断价值

王伟，郑水平，罗琴

作者单位：荆门市中医医院，a脾胃一科，b肺病科，湖北 荆门 448000

胃癌是消化系统最常见恶性肿瘤之一，也是我国第二高发肿瘤［1］，其早期阶段临床表现不明显，很难早期诊断，导致死亡率升高［2］。目前胃癌诊断主要方法为胃镜检查，但此方法花费较大，检查时病人较为痛苦，因此寻找替代方法十分必要［3］。长链非编码RNA-肺腺癌转移相关转录因子1（long noncoding RNA metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1，lncRNA MALAT1）可通过调控细胞周期及细胞凋亡，参与肿瘤发生［4］。有研究表明，胃癌高危人群血清中胃蛋白酶原（pepsinogen，PG）水平处于异常状态，PG 可作为癌前病变的筛查指标［5-6］。然而目前关于lncRNA MALAT1、PG 联合应用于胃癌早期诊断的研究较少。因此，本研究通过探讨血清lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ水平在早期胃癌中的诊断价值，以期为胃癌早期临床诊断和及时治疗开辟新思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017 年3 月至2019 年4 月入住荆门市中医医院的96例胃癌病人（病人经胃镜检查和病理检查确诊，并进行胃癌切除手术）为研究对象，最终纳入其中TNM 分期Ⅰ～Ⅱ病人67 例（早期胃癌组），男37例，女30例；年龄范围为44～73岁，年龄（58.64±12.38）岁；TNM 分期Ⅲ～Ⅳ病人29 例（进展期胃癌组），男16 例，女13 例；年龄范围为44～76 岁，年龄（58.47±13.26）岁；同期选取82 例健康体检者作为对照组，男43 例，女39 例；年龄范围为45～74 岁，年龄（59.73±14.36）岁。三组性别、年龄比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

纳入标准：①符合2010年卫生部发布且实施的胃癌诊断标准［7］，且经胃镜及病理组织学检查确诊为胃癌者，且病人未进行放化疗等治疗；②临床资料记录清晰者；③对照组无胃十二指肠疾病史；④无其他消化系统疾病者。排除标准：①有肝、肾、心、肺等脏器功能不全疾病及相关手术史者；②伴有感染性疾病者；③入院前一个月服用影响血清指标检测药物者；④同时参与其他研究者。本研究中所有病人均由两名及以上主治医师明确诊断，所有受试对象均由专业人员详细告知本人及近亲属研究内容并同意参加，同时签署知情同意书。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

检查各胃癌病人肿瘤分化、肿瘤大小、阳性淋巴结百分比、神经浸润、血管侵犯、TNM 分期等临床病理参数。收集两组一般资料，包括年龄、性别、体质量指数（body mass index，BMI）、饮酒史、吸烟史。

1.2 主要试剂与仪器 PG I 试剂盒（货号WL8104A），购自北京利德曼生化股份有限公司；PG Ⅱ试剂盒（货号WL8104B），购自北京万泰德瑞诊断技术有限公司；RNA提取试剂盒（货号R1050），购自北京天漠科技开发有限公司；miScript SYBR®Green Mix（货号218073），购自上海齐一生物科技有限公司；AceQ qPCR SYBR®Green Mix（货号Q111-02），购自南京诺唯赞生物科技有限公司。ABI 7500实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRTPCR）仪，购自广州市百菱生物科技有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 样品采集及保存 抽取所有研究对象清晨空腹静脉血样，3 000 r/min 离心15 min 后收集血清，置于-80 ℃保存待测。

1.3.2 qRT-PCR 法检测血清中lncRNA MALAT1 水平 采用qRT-PCR 法检测两组血清中lncRNA MALAT1 表达水平。采用RNA 提取试剂盒提取血清总RNA，反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。采用qRT-PCR 仪对lncRNA MALAT1 进行扩增。qRTPCR 反应体系共20 µL：cDNA（50 µg/L）2 µL，miScript SYBR®Green Mix 10µL，正反向引物（10µmol/L）各0.8µL，ddH2O 6.4µL，引物由上海生工生物公司合成。反应条件：95 ℃变性5 min；95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃，30 s；45个循环。lncRNA MALAT1及内参GAPDH 的引物序列见表1。每份样品均设3个重复孔，采用2-ΔΔCt法对血清lncRNA MALAT1 含量进行定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3 检测血清中PGⅠ、PGⅡ水平 采用胶乳免疫比浊法检测血清PG I 和PG Ⅱ水平，具体操作步骤严格按试剂盒说明书进行。

1.4 统计学方法 利用SPSS 23.0 对数据进行统计学分析，计量资料以±s 表示，两组间比较行t 检验；计数资料以例表示，两组间比较行χ2检验；采用Pearson 法分析胃癌病人血清中lncRNA MALAT1 与PGⅠ、PGⅡ水平的相关性；ROC 诊断是否患胃癌。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同临床特征胃癌病人血清lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ水平比较 不同肿瘤分化、肿瘤大小、阳性淋巴结百分比、神经浸润、血管侵犯的胃癌病人血清lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ水平比较，均差异无统计学意义（P＞0.05）；TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期胃癌病人血清lncRNA MALAT1、PGⅡ水平显著高于Ⅰ～Ⅱ期，PGⅠ水平显著低于Ⅰ～Ⅱ期（P＜0.05）。见表2。

表2 不同临床特征胃癌病人血清lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ水平比较/±s

表2 不同临床特征胃癌病人血清lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ水平比较/±s

注：lncRNA MALAT1为长链非编码RNA-肺腺癌转移相关转录因子1，PGⅠ为胃蛋白酶原Ⅰ，PGⅡ为胃蛋白酶原Ⅱ。

病理参数肿瘤分化例数MALAT1t值1.42 P值0.158 PGⅠ/（µg/L）t值1.86 P值0.066 PGⅡ/（µg/L）t值1.86 P值0.067高低31 65 109.73±15.66 115.26±18.73 36.96±7.24 39.81±6.93 11.94±3.97 13.62±4.23肿瘤长径≤4 cm＞4 cm阳性淋巴结百分比≤9%＞9%TNM分期Ⅰ～ⅡⅢ～Ⅳ神经浸润0.57 0.573 1.80 0.075 1.96 0.053 24 72 118.73±19.77 121.54±21.46 37.95±7.42 41.37±8.26 12.72±2.38 14.36±3.85 0.83 0.412 1.51 0.134 1.91 0.060 28 68 116.24±18.43 119.75±19.16 46.54±7.23 49.21±8.12 11.97±2.19 13.22±3.17 6.66 0.000 13.93 0.000 25.09 0.000 67 29 103.24±16.85 128.43±17.43 50.46±8.23 31.43±5.01 6.92±1.38 22.53±4.67 1.25 0.214 1.79 0.077 1.93 0.057有无73 23 126.57±18.32 121.21±16.54 46.84±9.73 42.79±8.57 15.34±5.46 12.84±5.27血管侵犯1.61 0.112 1.59 0.115 1.58 0.117有无74 22 119.84±14.56 114.27±13.33 39.84±7.23 36.97±8.12 19.27±6.18 16.89±6.21

2.2 三组一般资料比较 三组性别、年龄、体质量指数、饮酒比例、吸烟比例等比较，均差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 三组一般资料比较/例

2.3 三组血清中lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ水平比较 进展期胃癌组血清中lncRNA MALAT1、PGⅡ水平显著高于早期胃癌组和对照组，PGⅠ水平显著低于早期胃癌组和对照组（P＜0.05）；早期胃癌组血清中lncRNA MALAT1、PGⅡ水平显著高于对照组，PG Ⅰ水平显著低于对照组（P＜0.05）。见表4。

表4 三组血清中lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ水平比较/±s

表4 三组血清中lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ水平比较/±s

组别对照组早期胃癌组进展期胃癌组F值P值例数82 67 29 lncRNA MALAT1 86.25±19.58 103.24±16.85 128.43±17.43 59.44＜0.001 PGⅠ/（µg/L）64.78±12.94 50.46±8.23 31.43±5.01 117.42＜0.001 PGⅡ/（µg/L）3.88±0.68 6.92±1.38 22.53±4.67 858.48＜0.001

2.4 胃癌病人血清中lncRNA MALAT1 与PGⅠ、PG Ⅱ水平的相关性 胃癌病人血清中lncRNA MALAT1 水平与PGⅡ呈正相关，与PGⅠ呈负相关（r=-0.58、0.70，均P＜0.05）。

2.5 血清中lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ水平对早期胃癌的诊断价值 以lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ单个指标及三者联合预测值为检验变量绘制ROC 曲线，结果显示，lncRNA MALAT1 诊断早期胃癌病人的AUC 为0.77［95%CI（0.70，0.84）］，截断值为103.03，此时的特异度为89.0%，灵敏度为63.5%；PG Ⅰ诊断早期胃癌病人的AUC 为0.85［95%CI（0.79，0.91）］，截断值为52.63 µg/L，此时的特异度为80.5%，灵敏度为75.0%；PGⅡ诊断早期胃癌病人的AUC 为0.81［95%CI（0.75，0.87）］，截断值为20.36 µg/L，此时的特异度为65.9%，灵敏度为83.3%；lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ联合诊断早期胃癌病人的AUC 为0.89［95%CI（0.84，0.94）］，特异度为81.3%，灵敏度为85.4%。

3 讨论

胃癌因早期临床症状不明显经常导致错失最佳治疗时机，且影响胃癌预后，使得胃癌死亡率成为各种恶性肿瘤第3 位，对人类健康和生命的危害较大［8］。目前胃癌大多依靠于胃镜检查，不仅费用昂贵，且对操作人员的技术要求较高，有时难以早期确诊，大多数病人确诊时已处于中晚期［9］。目前临床上用于早期胃癌检测的其他生物标志物灵敏度和特异度不高，因此，寻找新的、可靠的早期胃癌诊断生物标志物已成为目前的研究热点。

LncRNA 是一类非编码RNA 的总称，其长度大于200 核苷酸，LncRNA 虽不编码蛋白质，但在肿瘤的发生、发展中能发挥调控作用［10］。LncRNA MALAT1 最初在非小细胞肺癌中被发现，在哺乳动物进化中高度保守，参与许多肿瘤的发生［11］。lncRNA MALAT1 在多种肿瘤中呈高表达，如肺癌、宫颈癌、乳腺癌等，具有促进肿瘤细胞增殖、转移、侵袭及上皮间质转化的作用［12-13］。PG 分为PGⅠ和PGⅡ两种同工酶原，是由胃黏膜分泌的胃蛋白酶前体物质，能够反映胃黏膜状态的变化。PGⅠ、PGⅡ主要由胃主细胞、颈黏液细胞以及少量组织腺体合成，是参与消化的一种蛋白酶前体物质。PG合成后仅有少量经胃黏膜进入血液循环，因此检测血清PG水平的变化可判断胃黏膜状态［14］。刘永等［15］通过检测、对比、分析胃癌病人和健康者血清中癌胚抗原、糖类抗原724、lncRNA MALAT1 水平，将三者联合用于胃癌检测，证明其可用于胃癌发病风险的预测且具有诊断价值。本研究结果表明不同肿瘤分化、肿瘤大小、阳性淋巴结百分比、神经浸润、血管侵犯等胃癌病人血清lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ水平比较，均差异无统计学意义；进展期胃癌组血清中lncRNA MALAT1、PGⅡ水平显著高于早期胃癌组和对照组，PGⅠ水平显著低于早期胃癌组和对照组，早期胃癌组血清中lncRNA MALAT1、PGⅡ水平高于对照组，PGⅠ水平显著低于对照组。提示血清lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ与早期、进展期胃癌病情均密切相关，对胃癌检出有重要提示作用，且在胃癌临床分期中有一定的应用价值，推测PGⅠ、PGⅡ可能通过影响胃黏膜损害而影响胃癌的进展。本研究中lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ对血管侵犯、神经浸润等临床病理特征的判断价值不高。

本研究一般资料中，对照组、早期胃癌组、进展期胃癌组性别、年龄、体质量指数、饮酒比例、吸烟比例等比较，均差异无统计学意义，具有可比性，对实验研究结果不产生影响。进一步研究发现胃癌病人血清中lncRNA MALAT1 水平与PGⅡ呈正相关，与PGⅠ呈负相关。进一步提示血清lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ可能通过差异表达参与胃癌病情发展。lncRNA MALAT1 诊断早期胃癌病人的AUC 为0.77，截断值为103.03，此时的特异度为89.0%，灵敏度为63.5%；PGⅠ诊断早期胃癌病人的AUC 为0.85，截断值为52.63µg/L，此时的特异度为80.5%，灵敏度为75.0%；PGⅡ诊断早期胃癌病人的AUC 为0.81，截断值为20.36µg/L，此时的特异度为65.9%，灵敏度为83.3%。提示lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ对早期胃癌都有一定的诊断价值，且ROC曲线中PGⅠ的曲线下面积相较于其他两个更大，诊断价值相对更高。lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ联合诊断早期胃癌病人的AUC 为0.89，特异度为81.3%，灵敏度为85.4%。lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ联合检测时，早期胃癌诊断的AUC、灵敏度均显著提高。提示lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ联合检测优于各指标单独检测，提高lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ单独使用时的灵敏度，能提高其对早期胃癌的诊断价值。

综上所述，lncRNA MALAT1联合PGⅠ、PGⅡ可在一定程度上检出胃癌，为早期胃癌临床诊断及治疗提供理论依据及新思路，对降低胃癌发病率及死亡率有重要意义。提示在临床中需密切监测lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ水平的变化，以提高胃癌早期诊断。但本研究为回顾性研究，有部分遗失病例，资料完整性限制了研究，且样本数量较少、因素分析可能不够全面，需加大样本量进行深入的临床应用研究。