微小RNA-150靶向c-Myb表达对T淋巴细胞白血病Jurkat细胞增殖的影响

杨莉，刘炜，李彦格，管玉洁，毛彦娜

作者单位：郑州儿童医院、河南省儿童医院、郑州大学附属儿童医院血液肿瘤科，河南 郑州 450000

T 淋巴细胞白血病（T lymphoblastic leukemia，TLL）是血液系统恶性肿瘤，来源于骨髓T 淋巴母细胞，发病率、病死率较高，具有淋巴结增大、白血病细胞浸润、皮肤损害等特征，因常规治疗易复发、化疗疗效差，长期生存率低，预后较差，而成为临床治疗的难题［1-3］。微小RNA（miRNA）作为基因表达调控的重要方式，是迄今为止研究较多的一类非编码RNA，可调控靶基因广泛参与血液系统疾病及其他肿瘤的进展过程［4-5］。有研究发现，miR-452、miR-139 等表达异常可导致T-LL 的发生并影响疾病进展［6-7］。近年来有文献报道，miR-150 在慢性髓系白血病中表达下调，过表达miR-150 后可通过调节c-Myb 抑制人慢性髓系白血病细胞系K562 增殖［8］。然而，关于miR-150 靶向c-Myb 表达影响Jurkat 细胞增殖的报道较少。本研究自2020 年1—6 月研究miR-150 对人T-LL 细胞株Jurkat 中c-Myb 表达及细胞增殖、凋亡的影响，以期解释miR-150 在T-LL 中的功能及分子机制，为发展以miRNA为靶点的T-LL治疗新方法奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 人T-LL 细胞株Jurkat 细胞（WD100074，美国ATCC 细胞库）；Lipofectamine2000（11668-027，美国Invitrogen）；实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）试剂盒（：K1002S，美国Promega）；人胆囊收缩素/缩胆囊素八肽（CCK-8）试剂（CK-04，日本同仁）；AnnexinVFITC/PI（S0185，哈尔滨新海基因）；c-Myb 抗体（ab117635）、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗体（ab92552）、Bcl-2 相关X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗体（ab32503）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体（ab181602），美国abcam；羊抗兔（0295G-HRP，美国Santa）；ABI 7500 荧光定量PCR 仪，美国Applied Biosystems；BD FACSCanto Ⅱ流式细胞仪，美国BD；MODEL550 酶标仪、ChemiDocXRS 化学发光成像系统，美国Bio-Rad公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 Jurkat 细胞用DMEM 培养基于培养箱（37 ℃、5%二氧化碳）中培养，融合80%传代培养。

将Jurkat 细胞，分为空白对照组、阴性对照组及miR-150 过表达组，空白对照组Jurka 细胞不进行转染处理，使用Lipofectamine 2000，向阴性对照组、miR-150 过表达组Jurka 细胞分别转染negative control-miR-150、hsa-miR-150 mimic（序列由上海生工合成）。

1.2.2 qRT-PCR 法检测各组Jurkat 细胞中miR-150、c-Myb 表达情况 将Jurkat 细胞按照“1.2.1”分组处理6 h，重悬于DMEM培养基中，按照1×104个/孔铺于96孔培养板中，培养48 h，收集细胞，经总RNA提取、cDNA 合成后，qRT-PCR 法检测miR-150（内参U6）、c-Myb（内参GAPDH）水平。设置PCR 仪程序为95 ℃10 min；40 次循环：93 ℃10 s，55 ℃25 s，72 ℃ 2 min；72 ℃ 10 min。 miR-150（F）：5'-AGAGTCTCCCAACCCTTGTA-3'，miR-150（R）：5'-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'；c-Myb（F）：5'-GCTGCTATGGTCTTAGCCTGTAG-3'，c-Myb（R）：5'-ACATCAACAACACACATCTCC-3'；U6（F）：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，（R） ：5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′；GAPDH（F）：5'-GACCCCTTCATTGACCTCAA-3'，GAPDH（R）：5'-TGCTTCACCACCTTCTTGAT-3'，引物由上海生工合成。2-ΔΔCt法定量。

1.2.3 CCK-8 法检测Jurkat 细胞增殖 将Jurkat 细胞按照“1.2.1”分组处理6 h，重悬于DMEM 培养基中，按照1×104个/孔铺于培养板（96 孔），48 h 后加CCK-8，2 h后使用酶标仪（450 nm）检测光密度（optical density，OD）值。

1.2.4 流式细胞仪检测Jurkat 细胞凋亡 将Jurkat细胞按照“1.2.1”分组处理6 h，重悬于DMEM 培养基中，按照1×104个/孔铺于培养板（96孔），48 h后收集、消化、洗涤，调整成1×106个/毫升的细胞悬浮液，加入Annexin V-FITC、PI 各5 µL，1 h 避光孵育后使用流式细胞仪检测。

1.2.5 荧光素酶实验检测miR-150与c-Myb的靶向关系 生物信息学软件Targetscan 预测miR-150 和c-Myb mRNA 3'UTR 可能存在的结合位点。将与miR-150 互补结合的c-Myb 基因的3'UTR 序列片段插入到pGL3-basic构建3'UTR 质粒，将空载质粒（空载质粒组）和3'UTR 质粒（3'UTR 质粒组）分别与miR-150模拟物共转染Jurkat细胞。转染36 h后，检测细胞相对荧光素酶活性。

1.2.6 蛋白质印迹法（Western blotting）检测各组Jurkat 细胞中c-Myb、PCNA、Bax 蛋白表达情况 将Jurkat细胞按照1.2.1分组处理6 h，重悬于DMEM 培养基中，按照1×104个/孔铺于96孔培养板中，48 h后收集、洗涤、裂解、冰浴、离心，收集上清并进行蛋白定量。取等量蛋白经电泳、转PDVF 膜上、TBST 缓冲液（含5%脱脂奶粉）室温封闭，1 h 后分别加入c-Myb 抗体（1∶1 000 稀释）、PCNA 抗体（1∶1 000 稀释）、Bax 抗体（1∶1 000 稀释）和GAPDH 抗体（1∶1 000 稀释），孵育过夜，加入1∶5 000 稀释的羊抗兔二抗，孵育1 h，加入ECL试剂进行显影和曝光，分析条带灰度，以内参蛋白灰度定量。

1.3 统计学方法 采用SPSS 24.0 处理数据。数据均用±s 表示，行单因素方差分析，采用SNK-q 检验进行两两比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组Jurkat 细胞中miR-150、c-Myb mRNA表达情况 Jurkat 细胞中miR-150、c-Myb mRNA 水平在空白对照组与阴性对照组间差异无统计学意义（P＞0.05）。与空白对照组相比，miR-150 过表达组Jurkat 细胞中miR-150 水平升高（P＜0.05），c-Myb mRNA水平降低（P＜0.05），见表1。

表1 各组Jurkat细胞中miR-150、c-Myb mRNA表达水平比较/±s

表1 各组Jurkat细胞中miR-150、c-Myb mRNA表达水平比较/±s

注：①较空白对照组，P＜0.05。②较阴性对照组，P＜0.05。

组别空白对照组阴性对照组miR-150过表达组F值P值c-Myb mRNA 0.98±0.09 1.01±0.05 0.66±0.14①②22.43＜0.001重复次数666 miR-150 1.03±0.09 1.02±0.05 1.42±0.14①②31.01＜0.001

2.2 各组Jurkat细胞增殖、凋亡情况比较 空白对照组与阴性对照组Jurkat 细胞OD 值及凋亡率差异无统计学意义（P＞0.05）；与空白对照组相比，miR-150 过表达组Jurkat 细胞OD 值显著降低，凋亡率显著升高（P＜0.05），见表2。

表2 各组Jurkat细胞的OD值及凋亡率比较/±s

表2 各组Jurkat细胞的OD值及凋亡率比较/±s

注：①较空白对照组，P＜0.05。②较阴性对照组，P＜0.05。

组别空白对照组阴性对照组miR-150过表达组F值P值凋亡率/%8.76±0.74 9.13±0.88 20.79±1.15①②318.56＜0.001重复次数666 OD值0.46±0.09 0.49±0.08 0.25±0.06①②17.01＜0.001

2.3 miR-150 与c-Myb 的靶向关系 Targetscan 生物信息学软件预测显示，miR-150 和c-Myb mRNA 3'UTR存在结合位点。双荧光素酶报告基因实验显示，与空载质粒组相比，3'UTR 质粒组Jurkat 细胞相对荧光素酶活性显著降低［（0.68±0.16）比（1.01±0.11），t=4.16，P=0.002］。

2.4 各组Jurkat细胞中c-Myb、PCNA、Bax蛋白表达情况 空白对照组与阴性对照组Jurkat 细胞中c-Myb、PCNA、Bax 蛋白水平差异无统计学意义（P＞0.05）；与空白对照组相比，miR-150 过表达组Jurkat细胞中c-Myb、PCNA 蛋白水平降低（P＜0.05），Bax 蛋白水平升高（P＜0.05），见图1，表3。

表3 各组Jurkat细胞中c-Myb、PCNA、Bax蛋白水平比较/±s

表3 各组Jurkat细胞中c-Myb、PCNA、Bax蛋白水平比较/±s

注：GAPDH 为甘油醛-3-磷酸脱氢酶，PCNA为增殖细胞核抗原，Bax为Bcl-2相关X蛋白。①较空白对照组，P＜0.05。②较阴性对照组，P＜0.05。

组别空白对照组阴性对照组miR-150过表达组F值P值重复次数Bax/GAPDH 0.42±0.13 0.46±0.14 0.65±0.18①②3.72 0.042 666 c-Myb/GAPDH 0.64±0.12 0.73±0.13 0.37±0.06①②18.10＜0.001 PCNA/GAPDH 0.56±0.11 0.59±0.13 0.33±0.07①②10.74 0.001

图1 各组Jurkat细胞中c-Myb、PCNA、Bax蛋白表达

3 讨论

miRNAs 是一类进化中高度保守，分布广泛，长度为21～24 个核苷酸的非编码RNA，通过作用于靶基因，使靶基因转录受到抑制或mRNA 降解，从而负调控靶基因表达。近年来，对miRNA 的深入研究发现，miRNA 基因的突变或表达失调与多种癌症关系密切，可以通过发挥抑癌或促癌功能，参与癌症的发生发展，有望成为癌症的治疗靶点［9-10］。miR-150是研究较多的miRNAs 之一，其在多种实体肿瘤中均异常表达，可用于预测肿瘤发生发展及进行预后评估［11-12］。李均等［13］研究表明，miR-150在宫颈癌组织中高表达，可能作为癌基因调控宫颈癌的发生及发展。杜晓阳等［14］研究表明，过表达miR-150 能够抑制结直肠癌细胞的侵袭与转移能力，进而抑制肿瘤的生长与转移。因此，miR-150 在肿瘤中的调控具有多样性，可能发挥抑癌或促癌功能。王莹等［15］通过构建慢病毒载体过表达miR-150，发现过表达has-miR-150 可能通过负调控磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/核因子κB（phosphoinositide-3-kinase/serine threonine kinase/nucler factor κB，PI3K/Akt/NFκB）信号通路，抑制Jurkat 细胞增殖并诱导其凋亡。本研究结果显示，过表达miR-150后，Jurkat细胞OD值显著降低，凋亡率显著升高，提示miR-150在T-LL进展中起抑癌基因作用，这与王莹研究一致，但具体机制尚不清楚。

T-LL 的发生过程是原癌、抑癌基因间作用失衡的后果结果，其中，癌基因c-Myc 起重要作用，可通过细胞自噬机制、非细胞自噬机制诱导急性T-LL 表现出明显的原癌基因成瘾性，因此，针对c-Myc 基因进行治疗可能成为治疗急性T-LL 的突破方向［16］。吕国庆等［17］研究表明，c-Myc 抑制剂CPI-203 可明显抑制急性T 淋巴细胞白血病Jurkat 细胞增殖。但c-Myc 缺乏明确的配体结合域，特异性阻断c-Myc 基因激活十分困难，研究靶向抑制c-Myc 基因激活的方法具有重要意义［18］。周小翠等［19］研究表明，miR-150通过靶基因c-Myb改善心肌梗死后心肌纤维化。陈连香等［8］研究表明，miR-150 下调靶基因c-Myb 的表达抑制慢性髓系白血病细胞的增殖。何旭等［20］研究发现，T-LL病儿血浆miR-150水平降低，其水平检测对T-LL 诊断、病情判断和预后评估具有一定作用。本研究结果显示，过表达miR-150 后，Jurkat 细胞中c-Myc mRNA 和蛋白水平均显著降低，提示miR-150 在Jurkat 细胞中可以阻断c-Myc 基因激活，且双荧光素酶报告基因实验结果证实，miR-150 在Jurkat细胞中可以靶向调控c-Myc基因。

PCNA 是增殖相关基因，在肿瘤增殖过程中发挥作用［21］。Bax 是B 淋巴细胞瘤-2 蛋白（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）家族的促凋亡成员，可促进细胞凋亡［22］。本研究发现，过表达miR-150 后，Jurkat 细胞中PCNA 蛋白水平显著降低，Bax 蛋白水平显著升高，提示miR-150 靶向阻断c-Myc 基因激活后，通过下调PCNA 表达、上调Bax 表达抑制Jurkat 细胞增殖并促进其凋亡。

综上所述，miR-150 可能靶向c-Myb 表达，进而通过影响PCNA、Bax 表达抑制Jurkat 细胞增殖并诱导其凋亡，这可能为靶向治疗T-LL 提供了一定参考。