基于网络药理学探讨当归芍药散延缓皮肤光老化的机制

刘梦涵 田黎明 柯 丹 韩 苗 张鹏程 李 恒 宗世琴 洪 怡张 翀 田代志 陈 龙

（1.江汉大学医学院，湖北 武汉，430056；2.武汉市中西医结合医院皮肤科，湖北 武汉，430022；3.重庆市中医院皮肤科，重庆，400000；4.湖北省中医院皮肤科，湖北 武汉，430061；5.湖北中医药大学，湖北 武汉，430065）

皮肤光老化是皮肤受到过量的紫外线暴露导致的损伤，在外观上主要表现为皮肤粗糙、干燥、弹性降低、皱纹加深加粗、色素异常分布以及毛细血管的扩张等，严重时甚至引起各种皮肤病变，如日光性角化病、恶性肿瘤等。与皮肤自然衰老相比，光老化在面部等光暴露部位的皮肤衰老中占据80%以上。因此，如何减缓光老化引起的皮肤损害显得尤为重要。目前，临床上可以通过药物或者防晒等多种手段进行干预。

经典名方当归芍药散出自《金匮要略》，传统主治痛经、盆腔炎以及慢性肾脏病等疾病。在皮肤科领域，亦可用于痤疮和黄褐斑等的治疗。随着长期的实践探索及药理学研究的深入，其临床应用也在不断丰富。经现代研究证实，当归芍药散具有清除自由基、抗氧化损伤、抑制炎症反应、调节免疫等作用。目前，尚未有已发表的刊物阐明其提取物中抗氧化有效成分、作用靶点、疾病及通路之间的联系。

近年来，鉴于生物信息学、系统生物学和多元药理学的快速发展，网络药理学在世界范围内兴起。网络药理学是通过网络科学的方法，在“疾病-基因-靶点-药物”的基础上，从系统和整体的角度阐述生物系统、药物和疾病之间的复杂性，具有系统性、相关性和可预测性的特点。本研究采用网络药理学的方法，探讨当归芍药散延缓皮肤光老化损伤的药效物质基础及作用机制，并为其开发利用提供参考。

1 资料与方法

1.1 当归芍药散的活性成分筛选

运用 TCMSP 数据库（http：//www.tcmspw.com/ tcmsp.php），设定筛选条件为口服生物利用度（OB）≥30%、药物相似度（DL）≥0.18，分别检索出“当归”“白芍”“茯苓”“泽泻”“川芎”及“白术”中已报道的有效活性成分及相应靶点，并将获得靶点在UniProt数据库（https：//www.uniprot.org）中转换出标准化基因名，所有靶点均为人源化，并去除重复基因。

1.2 皮肤光老化相关靶点的筛选

以“photoaging”作为关键词，输入到GeneCards数据库（https：//www.genecards.org）中，筛选与皮肤光老化相关的靶点并去除重复靶点。运用Venny2.1.0软件对当归芍药散有效成分靶点与光老化相关靶点取交集，得到当归芍药散作用光老化的预测交集靶点。

1.3 当归芍药散活性成分-靶点网络图构建

在Cytoscape3.9.0软件中导入当归芍药散活性成分及相应靶点，绘制当归芍药散活性成分-靶点网络图。在该网络图中，根据每个节点（node）之间的连接数目与度值（degree）的大小排序。节点间联系越多，度值越大在网络中也越重要，提示可能为当归芍药散的核心成分或基因。

1.4 蛋白质相互作用（PPI）网络图构建

将当归芍药散与皮肤光老化的24个交集基因导入String数据库（https：//string-db.org），选择人源性物种，得到 PPI信息，将获得的数据导入Cytoscape3.9.0软件，根据度值和紧密中心度（Closeness Centrality）重新绘制PPI网络图。

1.5 基因本体分析（GO）与通路的富集分析（KEGG）

在David数据库（https：//david-ncifcef.goeL）输入上述核心作用靶点，获取显著富集基因的功能和相关通路信息。将上述获得的数据在微生信平台绘图进行可视化分析。

2 结果

2.1 当归芍药散有效活性成分

根据筛选要求，在TCMSP平台中共检索出当归芍药散54种活性化合物，其中当归2种，白芍13种，茯苓15种，川芎7种，泽泻10种，白术7种。在Uniprot数据库进行转换去重后获得对应的基因名107个。见图1。根据度值降序排序，居前的有效活性成分为β-谷甾醇（MOL000358）、山奈酚（MOL000422）、豆甾醇（MOL000449）、杨梅酮（MOL002135）、常春藤皂苷元（MOL000296），其中β-谷甾醇为当归、白芍共有成分，谷甾醇为白芍、川芎、泽泻共有成分，这些可能为当归芍药散延缓皮肤光老化的核心药效成分。

2.2 当归芍药散和皮肤光老化共同作用靶点

在Gene-Cards数据库中收集皮肤光老化靶点，剔除重复数据后得到234个。利用Venn分析工具，绘制当归芍药散化学成分与皮肤光老化相关的靶点韦恩图，共有24个共同靶点。见图2。通过STRING网站及Cymscape3.9.0软件，对24个共同靶点进行可视化分析，得到PPI网络，该网络涵盖24个节点、157条边，局部聚类系数为0.836、平均度值为13.1。在Cymscape3.9.0软件中，根据度值和最短路径筛选出前 10位关键靶点，分别为 TNF、AKT1、IL6、PTGS2、CASP3、JUN、MAPK8、CAT、MAPK14、CASP8。 用 Cymscape3.9.0 对STRING得到的数据进行可视化。见图3。

2.3 GO生物功能分析结果

将24个共同靶点输入David网站中，进行GO功能富集分析（P＜0.05），共得到GO条目175条，包括生物学过程（BP）136条、细胞组成（CC）10条、分子功能（MF）29条。根据P值由低到高进行排序，分别取BP、CC、MF排名前10个条目做可视化分析。见图4。生物学过程相关性最大的条目依次为对雌二醇、有机环化合物的反应、参与凋亡过程的半胱氨酸型内肽酶活性的激活、凋亡过程的正调控、对序列特异性DNA结合转录因子活性的正调控、一氧化氮生物合成过程的正调控、对基因表达的负调控、对平滑肌细胞增殖的正调控、细胞对机械刺激的反应以及衰老；与细胞组成密切相关的条目为细胞质、线粒体、细胞核、过氧化物酶体、死亡诱导信号复合物等；分子功能相关性最大的条目依次为酶结合、RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性、类固醇激素受体活性以及参与凋亡过程中的半胱氨酸型内肽酶活性、雌激素激活特定DNA结合序列等。

2.4 KEGG富集通路分析结果

KEGG分析得到71个条目（P＜0.05），对其排名前20的条目绘制气泡图展示（见图5），主要包括乙型肝炎、癌症途径、非酒精性脂肪肝、恰加斯病（美国锥虫病）、TNF信号通路、弓形虫病、结核病、结直肠癌、Toll样受体信号通路、凋亡、百日咳、破骨细胞分化、肌萎缩侧索硬化症（ALS）、甲型流感、利什曼病、催乳素信号通路、FOXO信号通路、小细胞肺癌、阿米巴病及军团菌病。以上数据提示，当归芍药散延缓皮肤光老化的作用可能与上述信号通密切相关。

3 讨论

UV辐射引起的皮肤光老化作用机制复杂，涉及多种信号分子以及多条信号转导通路。目前，认为主要与氧化应激、炎症反应与免疫抑制、基质金属蛋白酶（MMPs）的作用、细胞凋亡等有关。随着对皮肤光老化机制的深入研究，各种抗光老化损伤的手段也应运而生。近年来，国内外对中药防治光老化的研究日益增多，越来越多的中药有效成分抗皮肤光老化的效果得到了认可。

本研究以网络药理学为切入点，通过对有效成分的筛选、靶点预测、网络可视化构建以及生物信息分析，预测了当归芍药散延缓皮肤光老化的潜在作用机制。本研究发现当归芍药散中β-谷甾醇、豆甾醇、山奈酚、杨梅酮等与靶点间联系数目最多，可能是其核心活性成分。

药理研究表明，它们都具有抗炎、抗氧化和预防肿瘤等多种功能。β-谷甾醇具有清除羟自由基、超氧阴离子的能力。在酒精性肝损伤小鼠模型中，β-谷甾醇可以降低谷胱甘肽的消耗、恢复抗氧化酶活性、减少丙二醛过量产生缓解乙醇引起的氧化应激。β-谷甾醇可以增强转录因子Nrf-2表达，调节细胞的氧化还原状态，同时抑制肿瘤坏死因子α（TNF-α）等炎症因子的聚集与释放，阻断NF-κB信号的活化，降低MMPs介导的细胞外基质降解，进而延缓光老化。豆甾醇、杨梅酮和山奈酚也有类似的抗氧化功能，通过抑制活性氧的产生、抑制MMPs的表达、抗炎等多种作用延缓皮肤衰老。

在基因靶点层面，本研究预测出TNF、IL-6、PTGS2、AKT1、CASP3、JUN、CAT等可能为当归芍药散延缓皮肤光老化的核心靶标。促炎介质TNF、白介素-6（IL-6）等的抑制可以降低MAPK、NF-κB信号通路诱导的激活蛋白1（AP-1）、MMPs表达，减少胶原降解，也可以下调环加氧酶2（PGTS2）、前列腺素等的合成，从而起到抗炎抗氧化的作用。蛋白激酶B同样在皮肤光老化的过程中发挥重要作用，在紫外线的照射下，雷帕霉素复合体2（mTORC2）活性增加，使体内Akt激活和Akt依赖的IκB激酶α（IKKα）磷酸化，p65发生易位和磷酸化，进一步引起皮肤的衰老。UV辐射可以通过Fas/FasL途径诱导细胞凋亡的发生，TNF-α、Fas/FasL与其受体结合，激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶Caspase-8，进而激活其下游效应蛋白Caspase-3，最终诱发细胞凋亡。JUN基因表达产物c-Jun蛋白磷酸化后可进入细胞核与c-Fos蛋白结合形成活化的AP-1，继而引起MMPs基因转录。过氧化氢酶（CAT）作为人体重要的抗氧化酶之一，主要参与活性氧的代谢，近期一项研究表明，改变CAT/超氧化物歧化酶（SOD）的组成可能逆转17β-雌二醇介导的细胞衰老。因此，当归芍药散可能通过上述靶基因在炎症反应、抗氧化活性、凋亡等方面发挥延缓皮肤光老化的作用。

GO生物功能分析结果显示，当归芍药散作用于皮肤光老化的靶点中，BP中涉及到对雌二醇的反应。雌二醇可以维持皮肤的厚度和水合作用，增加胶原蛋白和弹性蛋白的含量，减缓基质纤维的晚期糖基化最终产物（AGE）交联来防止皮肤老化。有研究表明，17β-雌二醇和植物雌激素可以通过调节人皮肤细胞的谷胱甘肽含量、ROS及一氧化氮释放、MMPs表达和线粒体膜电位来延缓皮肤衰老。此外，还涉及细胞凋亡过程的正调控、对一氧化氮生物合成过程的正调控、衰老等。以上结果提示，当归芍药散可能通过调节多种生物功能进而发挥延缓皮肤光老化的作用。

在20条KEGG结果中，TNF信号、Toll样受体信号以及FOXO信号通路可能为关键通路。TNF信号通路中TNF-α与特异性受体结合后，可以参与多种生物进程，促进细胞生长、分化、凋亡及诱发炎症等。皮肤受到UV辐射后，成纤维细胞及角质形成细胞中TNF-a会过度表达，并进一步导致细胞的早衰。目前，有研究表明这一过程可能p38 MAPK和ROS介导的结果。Toll样受体（TLRs）可激活多种信号介质，如PI3K、AKT、TRAF-6、MAPK等，进而促衰老的人真皮成纤维细胞中AP-1及炎症因子的表达。叉头转录因子FOXO作为公认的长寿基因，参与多种信号调控，包括能量代谢、细胞周期调节、细胞凋亡和维持氧化还原平衡等。FOXO家族成员在皮肤的老化和其他疾病中扮演重要角色，与色素沉着、创面再生、恶性黑色素瘤以及痤疮等密切相关，如在皮肤色素沉着中，激活FOXO6和FOXO3a可以上调抗氧化基因，减轻UVB诱导的氧化应激，抑制黑素生成。在伤口愈合过程中，FOXO1的激活与FOXO3的抑制可以促进角质形成细胞迁移，进而刺激正常皮肤的伤口愈合。

本研究结果表明，当归芍药散中β-谷甾醇、豆甾醇、山奈酚、杨梅酮等活性成分，可能通过多条信号通路，介导TNF、PTGS2、AKT1、JUN、CASP3和 IL-6等核心靶基因，在氧化应激、抗炎、调控凋亡等方面发挥延缓皮肤光老化的作用。本研究结果为进一步实验、深入验证当归芍药散药理作用及发挥其在临床中的整体疗效提供了依据。