缬沙坦原料药中7个亚硝胺类基因毒性杂质测定方法的建立及评价

陈 丹 汪嘉丽

随着人类老龄化速度的加快，慢性病已成为全球重大公共卫生问题[1]，高血压作为一种慢性非传染性疾病，是我国患病率、致残率较高的慢性疾病[2]。缬沙坦是新一代非杂环类、口服有效的高选择性血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）1 型受体（AT1）拮抗剂[3]，可以对AngⅡ介导的生理效应产生阻断作用，抑制相关的AT1[4]。缬沙坦治疗高血压疗效显著，且血压稳定，耐受性好，是理想的降压药物[5]。

2018年7月华海的缬沙坦原料药中被检测出N-亚硝基二甲胺（NDMA），多个使用华海缬沙坦原料药制剂厂家生产的沙坦类药物被召回。欧盟发布了1 个超级化合物结构，包含了目前所有的基因毒性杂质和潜在基因毒性杂质，例如磺酸酯类、卤代烷烃类和N-亚硝胺类等，基因毒性杂质能够直接或间接损伤细胞 DNA，产生致突变和致癌变作用[6]。因此需要建立缬沙坦原料药中7 个亚硝胺类杂质的测定方法，本方法建立了LC-MS/MS 法测定缬沙坦原料药中7 个亚硝胺基因毒性杂质，可以为缬沙坦的质量控制提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

电子天平：METTLER TOLEDO XPE205、METTLER TOLEDO XP205；Agilent 1290 Infinity II-6470QQQ 液质联用仪（Agilent 公司），大气压化学离子源（APCI），MassHunter 数据处理系统；旋涡混合器：XW-80A，上海医科大学仪器厂。

1.2 试剂

NDMA 对照品（N-亚硝基二甲胺）：BePure，C00005827，100 μg/ml；NMBA 对照品（N-亚硝基-4-甲基-4-氨基丁酸）：BePure，17753-024，100 μg/ml；NDEA 对照品（N-亚硝基二乙胺）：Dr.Ehrenstorfer，1004267ME，100 μg/ml；NEIPA 对照品（N-亚硝基乙基异丙胺）：BePure，C0007125，97.9 μg/ml；NDIPA对照品（N-亚硝基二异丙胺）：BePure，18091-001，100 μg/ml；NDPA 对照品（N-亚硝基二丙胺）：BePure，19686-030，100 μg/ml；NDBA 对照品（N-亚硝基二丁胺）：Dr.Ehrenstorfer，1022644ME，10 μg/ml；实验用水：屈臣氏蒸馏水，批号：20200520；甲酸：色谱级，东京化成工业株式会社，批号：DY46N；甲醇：质谱级，霍尼韦尔，DW921-CN。6 批缬沙坦原料药皆由同一厂家提供。

2 方法与结果

2.1 标准溶液的配制

精密量取NDMA、NMBA、NDEA、NEIPA、NDIPA、NDPA、NDBA 对照品溶液各0.5 ml，分别置50 ml 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀即得1 μg/ml 对照品储备液；精密量取NDBA 对照品溶液2 ml 置20 ml 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀即得1 μg/ml 对照品储备液。再用甲醇定量稀释制成每毫升含1 ng、2 ng、5 ng、10 ng、20 ng、50 ng、100 ng 的混合对照品溶液。

2.2 色谱及质谱条件

2.2.1 色谱条件色谱柱：Agilent poroshell PFP（100 mm×2.1 mm，2.7 μm），泵混合器与进样器之间接Agilent poroshell 120EC-C18（4.6×50 mm，2.7 μm）；柱温：40 ℃；流速：0.4 ml/min；自动进样温度：4 ℃；进样量：2 μl；NDMA、NMBA、NDEA、NEIPA、NDIPA、NDPA、NDBA 的保留时间分别为1.09、1.88、3.35、4.52、5.48、5.74、8.02 min。8.2 min 之后切出质谱。

流动相A：0.1%甲酸的水溶液；流动相B：甲醇；洗脱梯度：0.0～1.5 min，10%B；1.5～3.0 min，30%B；3.0～5.0 min，50%B；5.0～7.0 min，55%B；7.0～9.0 min，95%B；9.0～10.0 min，95%B；10.0～10.1 min，10%B；10.1～15.0 min，10%B。

离子源：APCI+；检测模式：多反应监测（MRM）模式；干燥器温度250 ℃，鞘气温度350 ℃，电离电压1 500 V，电晕针电流6 μA，雾化气压力35 psi，干燥气流速4 L/min。质谱采集时间为0～8.2 min。

2.2.2 质谱条件7 个组分质谱参数见表1。

表1 7 个组分质谱参数

2.3 专属性

取空白溶剂和混合杂质对照品溶液分别进样，采集色谱图，7 个组分均能有效分离。见图1～2。

图1 空白溶剂LC-MS/MS 分析

图2 7 个组分的LC-MS/MS 分析

2.4 范围及线性

按照2.1 线性标准溶液的配制方法进行溶液配制并且进行LC-MS/MS 分析，记录色谱图，制备标准曲线。以浓度（ng/ml）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标绘制标准曲线，得到线性方程如下。NDMA：Y=37.38X+10.74，r=0.999 8；NMBA：Y= 61.48X-4.15，r=0.999 8；NDEA：Y=69.19X-2.45，r=0.999 8；NEIPA：Y=251.37X+27.69，r=0.999 8；NDIPA：Y=106.02X-5.55，r=0.999 9；NDPA：Y= 221.08X-8.06，r=0.999 4；NDBA：Y=193.56X+119.08，r=0.999 5。

结果表明，NDMA、NMBA、NDEA、NEIPA、NDIPA、NDPA、NDBA 在1～100 ng/ml 范围内浓度与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 检测限与定量限

取2.1 项下杂质对照品溶液，用甲醇稀释直至各杂质的信噪比约为10 时的浓度作为定量限，信噪比约为3 时的浓度作为检出限。见表2。

表2 7 个亚硝胺杂质检出限、定量限

2.6 精密度（重复性）

取标准曲线1 溶液2 μl 连续进样6 次，计算NDMA、NMBA、NDEA、NEIPA、NDIPA、NDPA、NDBA 杂质峰面积的相对标准偏差（RSD）分别为3.02%、5.12%、5.13%、6.26%、7.71%、4.46%、3.24%，RSD 均小于8%。

2.7 样品溶液中的亚硝胺类杂质测定

2.7.1 样品溶液的配制精密称取缬沙坦0.2 g，4 批称样量分别为0.222 0 g、0.203 5 g、0.212 8 g、0.216 5 g，至离心管中，精密加入甲醇10 ml，涡旋混匀1 min，溶解后经0.22 μm 滤膜滤过，取续滤液测定即可。

2.7.2 测定结果依次取上述溶液各2 μl 进样，6 批缬沙坦原料药中7 个基因毒性杂质均未检出。

2.8 准确度（加样回收率）

2.8.1 缬沙坦原料药溶液的配制低浓度加样回收率样品溶液的配制方法：精密称取本品约200 mg，置离心管中，加标准线性4 溶液（10 ng/ml）1 ml，用甲醇稀释至10 ml，涡旋混匀1 min，经0.22 μm 滤膜滤过，取续滤液即可，平行制备3 份。

中浓度加样回收率样品溶液的配制方法：精密称取本品约200 mg，置离心管中，加标准线性7 溶液（100 ng/ml）1 ml，用甲醇稀释至10 ml，涡旋混匀1 min，经0.22 μm 滤膜滤过，取续滤液即可，平行制备3 份。

高浓度加样回收率样品溶液的配制方法：精密称取本品约200 mg，置离心管中，加7 个杂质对照品储备溶液（1 000 ng/ml）各1 ml，用甲醇稀释至10 ml，涡旋混匀1 min，经0.22 μm 滤膜滤过，取续滤液即可，平行制备3 份。

2.8.2 结果结果表明，低、中、高不同浓度溶液准确度在86%～102%，准确度良好。见表3。

表3 缬沙坦加样回收率(%,n=3)

3 讨论

在实验初期，发现空白溶液中NDBA 处有很大的干扰峰，查阅文献[7]，发现该位置的干扰峰为流动相中的水引入，为了除去该干扰物质，在混合器与进样器之间连接Agilent poroshell 120EC-C18（4.6×50 mm，2.7 μm）的色谱柱，通过延长该干扰峰的保留时间，使其与NDBA 完全分离[7]。

缬沙坦在水中几乎不溶，在甲醇中易溶，所以选择用甲醇作为溶剂，为了保证实验结果准确，所有供试品相关溶液均为临用新制。专属性及精密度实验表明空白溶剂对各组分检测无干扰，该检测方法精密度良好[8]，NMBA 存在顺反异构体，其色谱峰存在肩峰，定量分析时合并峰面积进行计算。7 个杂质中NDBA 在最后出峰，时间为8.02 min，缬沙坦出峰时间大约为 9 min，为了保护离子源不被污染，故采集时间为0～8.2 min，之后切出质谱。

查阅文献[9-11]，现阶段同时测定NDMA 和NDEA 的分析方法，以气相色谱-质谱联用法为主；液相色谱-质谱联用技术是将色谱的高效分离能力和质谱的高灵敏度特点相结合的分离分析技术，既具有LC 的常温色谱分离能力，又具有串联质谱的高选择性和准确性[12]，且灵敏度更高，离子源种类也更多，检测样品时，APCI 电离后的响应更大，背景干扰更小，基质诱导离子抑制效应更小，因此使用APCI 的基质干扰更小，更有利于N-亚硝胺类的定量分析[13]。该方法灵敏准确，专属性强，可用于缬沙坦原料药中7 个亚硝胺类杂质的定性与含量测定，为生产企业和药品监督部门进行质量控制提供有效保障。