内关穴位埋线对大鼠心肌梗死后心肌肥大的影响及作用机制*

平兰芝 黄小楼 ，2△ 胡天俊，3 姜 洪，2 吴高鑫，2△

（1.贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025；2.贵州中医药大学第一附属医院，贵州 贵阳550025；3.贵州省盘州市中医院，贵州 盘州 553500）

心肌梗死是由急性或持续性缺血、缺氧引起心肌坏死性疾病[1]，最终导致心力衰竭，引起死亡[2-3]。心肌肥大通常被认为是心肌梗死后的适应性反应[4]，长期刺激最终发展为适应不良的心脏重构和心力衰竭[5]，因此抑制心肌肥大已成为治疗心肌梗死的潜在靶点。心肌细胞蛋白质合成是心肌肥大的关键特征之一[6]，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路调控蛋白质合成[7]，参与了心肌肥大的发生和发展[8]。穴位埋线是在传统针具和针法基础上建立和发展起来的一种融合多种疗法、多种效应于一体的复合性治疗方法[9-10]，是针灸学的一种延伸和发展。研究表明[11-12]针刺能够减少心肌梗死面积，穴位埋线能改善心肌缺血状态，产生心肌保护效应[13-14]。本研究通过建立心肌梗死大鼠模型，旨在观察穴位埋线对大鼠心肌梗死后心肌肥大的影响，进一步探讨穴位埋线治疗心肌梗死的作用机制，为穴位埋线在临床上防治心肌梗死提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠20只，8～10周龄，体质量（200±20）g，购于长沙市天勤生物技术有限公司，许可证编号：SCXK（湘）2019-0014，饲养于贵州中医药大学动物中心实验室，湿度50%～70%，室温20～25℃，适应性喂养1周后造模。本实验过程遵照动物伦理学规定。

1.2 试药与仪器

培哚普利叔丁胺片（施维雅天津制药有限公司）。HE试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），ANP（ab209232）购自美国Abcam公司，p-mTOR（ab137133-40UL）购自美国 Abcam公司，mTOR（ab32028-40UL）购自美国Abcam公司，p-P70S6K（9204S）购自美国CST公司，P70S6K（2708T）购自美国CST公司，p-4EBP1（2855T）购自美国CST公司、4EBP1（9644T）购自美国CST公司，羊肠线（山东博达医疗用品股份有限公司）。小动物呼吸机（原阳县振华教学仪器有限公司），心电图机（广州市三锐电子科技有限公司），高分辨率小动物超声系统（加拿大Visual Sonics公司）。

1.3 模型制备

采用左冠状动脉前降支结扎术制备大鼠急性心肌梗死动物模型。术前予1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，麻醉后将大鼠仰卧位固定于鼠板，剃毛备皮，予气管插管后连接小动物呼吸机。碘伏消毒术区，在胸骨左侧第3、4肋间隙横向切开皮肤，钝性分离肌肉组织，沿左第三、四肋打开胸腔，用开胸器置于平行于肋间方向摆放，将无菌湿棉球撕成长条状向下压迫左肺以保护肺脏，撕开心包膜，充分暴露心脏，以冠状动脉主干为标准，用5/0无菌带线缝合针在左心耳下2 mm处结扎左冠状动脉前降支。以结扎部位及以下心肌变白为结扎成功的标志。结扎后腹腔注射0.2 mL利多卡因注射液预防心律失常和0.2 mL呋塞米减轻心脏容量负荷。取出压迫左肺的棉球，将心脏复原，取下开胸器，关胸缝合，脱离呼吸机，观察大鼠恢复自主呼吸后拔管。术后连续3 d予青霉素20万U/d腹腔注射预防感染。假手术组同模型组手术步骤一致，仅将手术线穿过左冠状动脉前降支，不结扎，打松结。整个手术过程严格无菌操作，心电图（ECG-3303B）肢导ST段弓背向上抬高并且术后第2大鼠心电图I、aVL或V1～V6导联出现病理性Q波时为造模成功标志。

1.4 分组与给药

将造模成功的大鼠随机分为模型组、内关埋线组，另设假手术组，每组5只。各组分别于术后第2天开始灌胃给药及内关穴埋线治疗，培哚普利组予培哚普利（40 mg/kg）灌胃给药，模型组、假手术组和内关埋线组予等量蒸馏水灌胃，每日1次。内关取穴参照第2版《实验针灸学》，将3-0羊肠线剪成0.2～0.5 cm小段，将其从7号一次性埋线针针尖穿入，再将针芯从注射针针尾部穿出。为确保羊肠线准确埋入穴位，内关斜刺6 mm，退出针头并检查有无线头外露。第7天行相关检查。

1.5 观察指标

1.5.1 超声检测左心功能指标 各组于取材前1 d行超声心动检查，予3%异氟烷吸入麻醉后，取左室短轴切面，探测M型曲线，取3个连续心动周期，计算平均值。记录主要参数：左室射血分数（LVEF）、左室短轴率（LVFS）、左室舒张末内径（LVIDd）、左室收缩末内径（LVIDs），并统计结果。

1.5.2 HE染色 处死动物，取心肌组织用4%多聚甲醛固定，常规包埋切片，染色，梯度酒精脱水，二甲苯透明处理，中性树脂封片，切片于全景扫描仪中观察并采集图像。用Image-J软件测量横截面积。

1.5.3 免疫印迹法（Western blotting）检测梗死边缘区心肌肥大指标ANP和蛋白质合成相关指标的蛋白表达 取40 μg样本蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳20 min，转至PVDF膜，放入5%封闭液中水平摇床震荡60 min，加入5%封闭液配制好的一抗稀释液，ANP、mTOR、p-mTOR、P70S6K、p-P70S6K、4EBP1、p-4EBP1（1∶500），4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，15 min，加入相对应的二抗（二抗稀释度1∶1 000）水平摇床震荡60 min，再次用TBST洗膜3次，10 min，显影，保存图像。Image-J软件进行蛋白灰度值分析，各组目标蛋白灰度值分别与内参β-action比较得到相对光密度值。

1.6 统计学处理

应用SPSS26.0统计软件。计量资料以（）表示。多组差异比较采用单因素方差分析，两组间差异用LSD检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠心脏超声结果比较

见表1。与假手术比较，模型组大鼠LVEF、LVFS明显降低（P＜0.05），LVIDd、LVIDs显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，埋线组和培哚普利组LVEF、LVFS显著升高（P＜0.05），LVIDd、LVIDs显著降低（P＜0.05）。

表1 各组大鼠心脏超声结果比较（±s）

表1 各组大鼠心脏超声结果比较（±s）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05。下同。

组别假手术组模型组埋线组培哚普利组n 5 5 5 5 LVEF（%）81.53±4.66 31.57±3.97*51.42±7.35*△50.56±9.17*△LVFS（%）57.93±6.95 13.75±3.65*22.55±2.39*△23.93±3.38*△LVIDd（mm）6.62±0.49 10.09±1.06*8.52±0.38*△8.33±0.77*△LVIDs（mm）3.38±0.23 7.98±0.28*△6.81±0.37*△6.23±0.59*△

2.2 各组大鼠心肌HE染色及横截面积比较

HE结果显示：假手术组心肌细胞形态大小正常，心肌细胞排列整齐有序，细胞核位于细胞中央，未见炎性细胞浸润。与假手术组相比，模型组心肌细胞呈现增生肥大改变，细胞形状不规则，排列错乱，细胞核游离，细胞间质增多，可见不同程度的炎症细胞浸润。与模型组比较，埋线组和培哚普利组心肌细胞的肥大改善，心肌细胞形态较为规则，心肌细胞排列相对整齐，细胞核游离情况有所改善。见图1。

图1 各组大鼠心肌细胞切片（HE染色，400倍）

梗死边缘区心肌细胞的横截面积结果显示，与假手术组比较，模型组横截面积显著升高（P＜0.05），与模型组比较，埋线组和培哚普利组横截面积显著降低（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠心肌细胞横截面积及ANP蛋白表达水平比较（±s）

表2 各组大鼠心肌细胞横截面积及ANP蛋白表达水平比较（±s）

组 别n 心肌细胞横截面积（μm2）ANP蛋白假手术组模型组埋线组培哚普利组5 5 5 5 232.06±15.74 467.48±56.85*289.74±59.39△274.56±44.40△0.275±0.002 0.846±0.006*0.456±0.004*△0.670±0.003*△

2.3 各组大鼠梗死边缘区ANP蛋白表达比较

与假手术组比较，模型组ANP蛋白表达显著升高（P＜0.05），与模型组比较，埋线组和培哚普利组ANP蛋白表达降低（P＜0.05）。见图2。

图2 各组大鼠ANP蛋白表达条带

2.4 各组大鼠梗死边缘区mTOR、P70S6K和4EBP1蛋白表达比较

与假手术组比较，模型组p-mTOR/mTOR、p-P70S6K/P70S6K、p-4EBP1/4EBP1蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，埋线组、培哚普利组p-mTOR/mTOR、p-P70S6K/P70S6K、p-4EBP1/4EBP1蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。见表3，图3。

表3 各组梗死边缘区mTOR、P70S6K和4EBP1蛋白表达比较（±s）

表3 各组梗死边缘区mTOR、P70S6K和4EBP1蛋白表达比较（±s）

组别假手术组模型组埋线组培哚普利组n 5 5 5 5 p-mTOR/mTOR 0.366±0.020 0.860±0.015*0.604±0.011*△0.777±0.022*△p-P70S6K/P70S6K 0.608±0.010 0.628±0.011*0.522±0.024*△0.407±0.014*△p-4EBP1/4EBP1 0.731±0.005 0.999±0.012*0.795±0.009*△0.722±0.008△

图3 各组大鼠梗死边缘区mTOR、P70S6K和4EBP1蛋白表达条带

3 讨论

心肌梗死在中医属“胸痹”范畴，内关既是手厥阴心包经之络穴，又是八脉交会穴之一，通阴维脉，为治疗胸痹第一要穴，疏通心包络及阴维脉之气血，具有宽胸理气、通络止痛之功[15-16]。故本研究选用内关穴为治疗穴位。针灸治疗心血管疾病已被证实，临床研究发现内关埋线治疗冠心病能够减少心肌缺血发作次数、持续时间[17]，能良好地调节心血管的功能恢复[18]，且疗效显著。本研究重点观察内关穴埋线对心肌梗死后心肌肥大的影响，进一步探讨内关穴埋线可能的作用机制，并选用培哚普利作为对照组。

心肌梗死发生后，为了补偿功能性心肌细胞的损失，心脏通过一系列的结构改变来完成重构[19]。心肌肥大被认为是心脏重塑过程中的关键事件[20]。心房是ANP合成、储存和分泌的主要部位，参与体液和血压稳态的调节，在高血压和心脏病合并左室肥厚时，心室ANP的合成和释放增加[21]。本研究研究显示，大鼠心肌梗死后7 d ANP表达升高，在接受培哚普利治疗和内关穴穴位埋线治疗后ANP表达下降，与模型组比较，内关埋线组降低心肌肥大的程度。因此我们推测穴位埋线能够减轻心肌肥大程度，抑制ANP的表达。

心肌肥大的主要特征是蛋白质合成过多、心肌细胞大小增加和心室壁增厚，是导致心律失常和心力衰竭的主要危险因素[22]。mTOR是一种进化保守的非典型丝氨酸/苏氨酸激酶，属于磷酸肌醇3-激酶（PI3K）相关激酶家族，通过其下游效应器磷酸化真核起始因子4E（eIF4E）结合蛋白1（4EBP1）和p70核糖体S6激酶1（S6K1）来促进蛋白质合成，进而通过促进蛋白质来正向调节细胞生长和增殖[23]。P70S6K和4EBP1可以直接反映mTOR的活性[24]，在使用mTOR抑制剂后，磷酸化p70S6K和4EBP1将不再磷酸化[25]。心肌肥大的发生与发展受细胞内mTOR信号通路的调控[26]。研究表明，雷帕霉素（mTOR抑制剂）通过抑制p70S6K和4EBP1磷酸化抑制mTOR的活性，进而减轻压力超负荷引起的心肌肥大[27-28]。本研究结果显示，与假手术组比较，模型组mTOR、p-mTOR、P70S6K、p-P70S6K、4EBP1、p-4EBP1蛋白表达水平均显著升高；与模型组比较，埋线组与培哚普利组mTOR、p-mTOR、P70S6K、p-P70S6K、4EBP1、p-4EBP1蛋白表达水平均显著降低。结合心肌梗死边缘区心肌细胞的横截面积与ANP蛋白表达情况，我们推测穴位埋线可能通过抑制mTOR/p70S6K/4E-BP1信号来抑制蛋白质合成，进而改善心肌梗死和心肌肥大，保护心功能。

综上所述，内关穴埋线改善心功能可能是通过抑制mTOR/p70S6K/4EBP1通路，减少蛋白质合成，从而减轻心肌梗死后心肌肥大而实现的。一方面，穴位埋线可以通过抑制p70S6K和4EBP1的磷酸化，抑制mTOR的活性，减少蛋白质合成，达到减轻心肌梗死、心肌肥大的目的，实现保护心功能的效应。然而本研究缺乏远期观察，可将观察期延长至4个月，同时可加入细胞实验明确信号通路，这将是我们下一步研究的重点。