加味香连丸对急性放射性肠炎大鼠NF-κB信号通路的影响*

苏景阳 傅 越 王梦蕾 严 江 王 珏 林胜友

（浙江中医药大学附属杭州市中医院，浙江 杭州 310007）

放射性肠炎多为腹腔、盆腔及腹膜后恶性肿瘤予以放射线治疗后所引起的并发症，其发病机制与Toll样受体（TLRs）[1]亚型中的TLR-4[2]所下调的核转录因子-κB（NF-κB）信号通路产生的肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）在内的多种炎症因子有关。肠道黏膜炎症损伤后表现为受累组织黏膜炎症水肿、坏死，甚至组织纤维化。林胜友名医工作室主要开展中医药抗肿瘤复发、转移，放化疗增效减毒的临床及基础研究。林胜友教授为浙江省名中医，强调放射线归属于“火热毒邪”，自拟放射性肠炎经验方——加味香连丸，由炒川连、广木香、红藤、蒲公英、败酱草、马齿苋6味药组成，治以清热解毒、涩肠止泻，在放射性肠炎患者的治疗中取得了显著疗效，明显提高了患者生活质量。为进一步研究加味香连丸治疗放射性肠炎的作用机制，本团队制备急性放射性肠炎大鼠模型进行实验，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级SD雄性大鼠40只，2月龄，体质量（200±20）g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK（沪）2018-0006。每笼饲养5只，SPF饲料喂养，实验期间大鼠自由饮用蒸馏水，室温恒定26℃，相对湿度60%～70%，光照为12 h明暗交替。适应性喂养5 d，定期观察大鼠外形、体形、行动、有无异常损伤等。

1.2 实验药物 加味香连丸，组方：炒川连6 g，广木香 9 g，红藤 15 g，蒲公英 15 g，败酱草 15 g，马齿苋30 g。药材煎汁、过滤，浓缩至100%浓度，置4℃冰箱备用。思密达，博福一益普生（天津）制药有限公司，国药准字H20000690，规格：3 g×10袋。

1.3 试剂及仪器 试剂：TLR-4、NF-κB p65、IL-6、TNF-α试剂盒（福建省泉州市睿信生物科技有限公司）。仪器：医用直线加速器（瓦里安），光学显微镜（Nikon），恒温生化培养箱（博迅），冷冻高速离心机（美国Thermo），多功能酶标仪（美国Thermo），洗板机（美国Bio-Rad），移液器（德国，Eppendorf）。

1.4 模型制备 40只大鼠禁食12 h后，随机选取10只设为正常组，腹腔注射3%戊巴比妥1.5 mL/kg全麻后固定于有机玻璃板上，除正常组外，其余3组大鼠予直线加速器12-MV的X射线单次照射全腹部，腹部给予1 cm组织补偿，调整准直器光栅大小，上达剑突下，下至耻骨联合，范围大约5 cm×8 cm，源皮距100 cm，剂量率 200 cGy/min[3]。

1.5 分组与给药 照射后12 h，将大鼠随机分为模型组、加味香连丸组、思密达组，各10只。正常组、模型组予5 mL/kg生理盐水灌胃；加味香连丸组按照60 kg成人-动物实验药效比例表换算大鼠灌胃剂量。思密达组根据黄继汉等[4]药理实验中动物与人体间的等效剂量换算，由标准体质量到非标准体质量的公式为Db′=Da·Rab·Sb，按大鼠实际体质量算出所需思密达剂量并制成思密达混合液，每1 mL含0.283 g思密达，按0.283 g/kg灌胃。各组灌胃量均为5 mL/kg，每日1次，持续5 d。

1.6 标本采集与检测 1）观察各组大鼠一般状况，包括精神状态、饮食进水、毛色、反应灵敏程度、排便情况、体质量变化等。正常大鼠粪便为棕褐色，粒状；腹泻表现为含不消化食物、黏液样便、黄绿色稀水样便、脓血便等。精神状态、饮食进水、排便情况分为好、较好、一般、较差、很差，分别对应0分、1分、2分、3分和4分，评分越高，一般情况越差[5]。2）实验记录至大鼠大量死亡当天，剩余大鼠予CO2处死。在严格无菌条件下迅速打开腹腔，取出空肠中段及回盲部近端回肠中段组织后用10%甲醛固定液固定48 h，二甲苯脱脂，酒精脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，观察并记录各组大鼠肠组织病理改变。光镜下评估绒毛水肿程度，绒毛疏密度、高矮、脱落情况，隐窝结构，炎性细胞浸润，组织出血及溃疡等情况。按Chiu标准[6]对各组肠黏膜损伤分为6级。3）另取部分空肠、回肠组织用预冷的0.9%NaCl溶液冲洗干净后配置组织匀浆，根据TLR-4、NF-κB p65、IL-6、TNF-α试剂盒（酶联免疫分析法）说明书配置试剂进行检测，记录实验结果并分析数据。

1.7 统计学处理 采用2019版EXCEL汇总数据，SPSS23.0软件进行数据分析。采用独立样本T检验进行两两比较分析，结果以（）表示。P＜0.05为差异存在统计学意义，P＜0.01为差异有显著统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠形态学改变 见表1，表2。造模后大鼠精神状态较前萎靡，造模当晚模型组死亡1只；照射后第1天思密达组死亡1只，除正常组外各组大鼠饮食量减少，精神较前萎靡，大便成形。第2天大鼠体质量减轻，模型组大鼠可见水样便，加味香连丸、思密达组大鼠大便尚成形。照射后第3天模型组大鼠死亡2只，3组大鼠体质量持续性降低，反应迟钝，精神萎靡胆怯，成群蜷缩抱团，各组大鼠均出现水样便，模型组最明显。照射后第4天大鼠死亡12只（模型组5只、加味香连丸组4只、思密达组3只），大鼠均出现水样便，部分大鼠甚至出现脓血便，直肠脱垂，不欲饮食，体质量明显降低，呈嗜睡濒死状态。照射后第5天思密达组大鼠死亡4只，剩余大鼠极度萎靡，停止实验。放射后3组大鼠体质量、症状评分较正常组差异有统计学意义（P＜0.05），加味香连丸组与思密达组体质量差异无统计学意义（P＞0.05），症状评分存在明显差异（P＜0.05）。

表1 各组急性放射性肠炎大鼠体质量比较（g，±s）

表1 各组急性放射性肠炎大鼠体质量比较（g，±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05。下同。

组 别n 照射后第0天 照射后第1天 照射后第2天 照射后第3天 照射后第4天正常组模型组加味香连丸组思密达组10 10 10 10 254.12±4.54 254.62±5.72 250.60±10.60 253.11±5.30 255.40±4.70 245.67±4.87*238.50±8.42*242.00±4.03*257.00±4.97 233.33±6.28*230.50±6.45*233.78±4.55*265.50±7.91 210.89±15.14*207.20±10.00*207.44±5.61*272.30±8.76 191.00±5.67*192.50±4.18*194.60±3.51*

表2 各组急性放射性肠炎大鼠症状评分比较（分，±s）

表2 各组急性放射性肠炎大鼠症状评分比较（分，±s）

组 别n 照射后第0天 照射后第1天 照射后第2天 照射后第3天 照射后第4天正常组模型组加味香连丸组思密达组10 10 10 10 0 0 0 0 0 1.00±0.47*0.30±0.48*△0.44±0.53*△0 2.11±0.60*1.00±0.47*△1.22±0.67*△0 3.00±0.82*2.10±0.86*△2.56±0.88*0 3.50±0.71*2.83±0.75*3.00±0.63*

2.2 各组急性放射性肠炎大鼠大体解剖观察结果见图1。模型组、加味香连丸组及思密达组大鼠均可见胃内容物堆积、胃扩张，3组大鼠肠道组织较正常组增粗水肿、淤血青紫，其中模型组肠道组织青紫最明显，加味香连丸组表现相对较轻。

图1 大鼠大体解剖观察结果

2.3 各组急性放射性肠炎大鼠肠组织病理结果 见图2，图3。根据Chiu标准[6]进行分级：正常组绒毛密集、高度相似，无脱落情况，隐窝结构正常，组织无出血及溃疡，评为0级；模型组绒毛脱落、腺体萎缩明显，回肠部分可见固有层消化崩解，点状出血及坏死，淋巴组织增生，肌层、浆膜层破坏缺失，评为5级；加味香连丸组绒毛结构尚存，绒毛脱落变钝，部分血管暴露，评为4级；思密达组绒毛破坏明显，隐窝结构异常，淋巴组织增生显著，固有层消化崩解，可见点状出血，评为5级。

图2 各组大鼠回肠组织病理学观察（HE染色，100倍）

图3 各组大鼠空肠组织病理学观察（HE染色，100倍）

2.4 各组大鼠小肠组织 TLR-4、NF-κB p65、IL-6、TNF-α含量比较 见表3，表4。加味香连丸组急性放射性肠炎大鼠肠组织TLR-4、NF-κBp65含量及相关炎症因子IL-6、TNF-α含量较正常组无明显差异（P＞0.05），加味香连丸组各项指标较思密达组无明显差异（P＞0.05）。

表3 各组急性放射性肠炎大鼠肠组织TLR-4、NF-κB p65含量比较（pg/mL，±s）

表3 各组急性放射性肠炎大鼠肠组织TLR-4、NF-κB p65含量比较（pg/mL，±s）

组别n TLR-4回肠 空肠NF-κB p65回肠 空肠10正常组模型组加味香连丸组思密达组2 6 2 545.57±29.86 509.71±10.01 518.29±17.00 505.06±9.47 506.13±21.70 510.30±11.34 504.57±20.15 540.85±44.84 38.02±1.59 37.34±0.31 36.49±1.94 36.87±0.39 36.16±1.72 36.79±1.31 34.69±1.56 36.56±0.85

表4 各组急性放射性肠炎大鼠肠组织炎症因子含量比较（pg/mL，±s）

表4 各组急性放射性肠炎大鼠肠组织炎症因子含量比较（pg/mL，±s）

组别n正常组模型组加味香连丸组思密达组10 2 6 2 IL-6回肠31.77±1.45 32.24±0.06 31.81±1.19 31.48±0.40空肠30.77±0.98 32.53±0.86 31.14±1.41 31.60±0.27 TNF-α回肠65.27±2.91 67.45±0.94 66.15±2.09 65.10±2.88空肠63.01±2.27 67.34±1.79 65.67±3.43 65.85±3.45

3 讨论

加味香连丸组TLR-4、NF-κBp65及相关炎症因子IL-6、TNF-α含量与正常组比较未见明显差异（P＞0.05），提示加味香连丸对NF-κB信号通路有一定影响，可能存在抗炎效果。恶性肿瘤多为“癌毒”内生所致[7-8]，放射线为火热毒邪，火毒外侵，直接损伤肠道，导致肠道清浊不分，传化失司，故大便稀溏或如水样，次数增多，腹胀腹痛。放射性肠炎急性期邪气亢盛，以祛邪为要。加味香连丸方中黄连清热燥湿，泻火解毒；木香辛行苦降，善行大肠之滞气；红藤善治肠痈，清热活血；蒲公英、败酱草、马齿苋清热消肿排脓。本方以清热解毒，祛湿止泻为主，能够有效针对放射性肠炎热毒外侵的发病机制。西医学认为电离辐射能促使过量的活性氧（ROS）和活性氮（RNS）产生从而诱导以NF-κB为核心的信号通路启动，促使TNF-α、IL-6等相关炎症因子释放，加重肠道黏膜炎症损伤。因此，急性放射性肠炎可以通过阿米福汀清除ROS减少炎症所致相关不良反应[9]、口服益生菌制剂促进黏膜成纤维细胞释放环氧合酶介导的前列腺素E2维持黏膜上皮完整性和耐受性[10]及健康人群菌群移植调节肠道菌群[11]等治疗。

Fiorino等[12]临床研究表明，小肠受照剂量≥5 Gy时，随着放射剂量的增加，不良反应逐渐增加，当放射剂量＞50 Gy时，可并发急性放射性肠炎。积极调控不同部位放射线剂量有利于减少相关并发症的发生。Chopra等[13]人员进行的一项多因素研究中表示约束V15＜250 cc、V30＜100 cc以及V40＜90 cc可使大肠三级毒性由26.7%降至5.4%。Mouttet-Aldouard等[14]临床也发现乙状结肠V30～40 Gy与“消化道毒性”显著相关（P＜0.006）。Smeenk等[15]则通过限制肛周不同肌肉照射放射剂量改善括约肌紧张度，同时降低大小便失禁的发生率。调强适形放疗因靶区精确剂量治疗以提高临床疗效并减少周围器官并发症而被推广开来。模型组、思密达组大鼠突然大量死亡考虑与放射线剂量过大、没有调强适形放疗有关，且与徐伟等[3]文献报道的12 Gy是最佳造模剂量有所差异，表明单次放射线最佳剂量选定仍需进一步证实。加味香连丸组大鼠症状改善不明显考虑与大剂量放射线超过个体可调节阈值、导致个体无法耐受致使免疫系统损害有关。加味香连丸组大鼠大体解剖及病理组织损害相对模型组及思密达组大鼠较轻，TLR-4、NF-κB p65、IL-6、TNF-α相关指标含量与正常组比较未见明显差异（P＞0.05），可见加味香连丸能影响急性放射性肠炎大鼠NF-κB信号通路的炎症指标，起到一定的保护治疗作用，但加味香连丸组大鼠相关检验指标与思密达组比较未见明显差异（P＞0.05），考虑可能与最终存活的大鼠耐受性较高或检验指标改善晚于临床有关，还需进一步延长实验周期加以证明。实验动物还可选用不同大鼠，如SD、Wistar大鼠[16]进行研究，不同品种大鼠差异性尚未比较，存在一定局限性。本研究以60 kg成人体质量为标准治疗剂量，给药剂量是由林教授临床不断积累经验后得出的结论，以此标准通过动物实验药效比例表换算成大鼠灌胃的剂量，初步对比加味香连丸汤剂与常用西药思密达对放射性肠炎的治疗效果，但后期仍需增设不同浓度剂量组别进行比较。此外后期应建立肿瘤相关大鼠放射性肠炎动物模型模拟人体肿瘤微环境，增设不同放射剂量、不同品种大鼠进行实验，增加常用中药组与加味香连丸进行比较以证实加味香连丸疗效，突显药物特色；检测指标应更加全面，进一步探查并确定加味香连丸相关药物成分与NF-κB信号通路上相关位点及检测指标的关系。