土茯苓-槐花药对治疗银屑病作用机制的网络药理学研究*

李腾飞 周妍妍 杨素清 闫景东△

（1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江哈尔滨 150040）

银屑病又称“牛皮癣”，是一种常见且又容易复发的系统性、炎症性皮肤病。银屑病临床表现为显著红斑的基础上覆盖多层白色鳞屑，可累及皮肤、关节、甲等各个部位。因其病情反复、根治不易，对患者机体以及精神产生了严重影响。经调查表明，该疾病在我国的总患病率由1984年的0.123%增长至2010年0.470%[1]，而全球银屑病的总患病率介于0.09%～5.10%之间[2]。虽然本病的发生机制尚未定论，但免疫学和遗传学研究已经确定白细胞介素-17（IL-17）和白细胞介素-23（IL-23）是银屑病发病的关键驱动因素，环境为其促发因素[3]。查阅古代中医文献发现银屑病与“白疕”最为相似，如《外科证治全书》记载白疕“皮肤瘙痒，起如疹疥而色白，搔之屑起”[4]。赵炳南认为银屑病在治疗上应该从血热、血燥以及血瘀出发，其中又属血热型最常见，故清热凉血解毒法为治疗银屑病的主要研究思路之一[5]。

土茯苓-槐花药对是中医皮肤科常用药对，具有除湿清热解毒的功用，来源于土槐饮，出自《赵炳南临床经验集》[6]。土茯苓性味甘、淡、平，归肝、胃、脾经，具有解毒除湿、通利关节的作用，其在调节免疫、镇痛、抗炎、抗氧化等方面均有显著的药理作用[7]。槐花性味苦，微寒，归肝和大肠经，可清肝泻火、凉血止血，现代药理研究结果表明其具有抗氧化、止血、保护胃肠、增强免疫、抗菌等作用[8]。目前，有关土茯苓-槐花药对治疗银屑病的相关信息主要以临床试验为主，其作用机制方向的研究相对缺乏。本课题组采用了网络药理学的研究方式，对土茯苓-槐花药对治疗银屑病的有效活性成分与作用靶点展开了分析研究，以此了解治疗银屑病的可能的作用机制，为临床应用提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 应用的数据库、软件及在线作图平台 主要包含UniProt（www.uniprot.org）、GeneCards（www.GeneCardss.）、DrugBank（www.drugbank.ca）、OMIM（omim.org）、String（cn.string-db.org）、Metascape（metascape.org）等数据库，TCMSP平台（old.tcmsp-e.com）、Cytoscape3.7.2、微生信在线作图平台（www.bioinformatics.com.cn）、Venny2.1在线作图平台（www.liuxiaoyuyuan.cn）等工具平台。

1.2 土茯苓-槐花活性成分及靶点信息的获取 利用TCMSP平台（中医药系统药理学数据库与分析平台），分别将“土茯苓”“槐花”作为关键词搜索，根据文献报道以及药代动力学参数将筛选标准制定为口服生物利用度（OB）≥30%，药物相同性（DL）≥0.18[9]，挖掘两种药物有效活性成分以及这些活性成分所对应的药物靶点信息，因为研究表明OB≥30%的化合物在口服后吸收良好，代谢缓慢，容易发挥药效；而DL≥0.18的化合物在化学上更加适合药物的研究与开发[10]。然后将这些靶点信息与Uniport数据库中的“人类”靶点数据相匹配，利用UniportKB功能，进一步获得其所对应的基因名称。

1.3 银屑病相关靶点的筛选 使用“Psoriasis”为搜索关键词，高关联性为标准，分别在Genecards、DrugBank、OMIM等疾病数据库中进行检索筛选，并将所获得的疾病基因合并后删除重复值，得到疾病的相关靶点数据。

1.4 构建药物活性成分-靶点网络图 使用Cytoscape3.7.2软件建立土茯苓-槐花药对的“有效活性成分-靶点”网络图。

1.5 获取土茯苓-槐花药对治疗银屑病的潜在作用靶点 将土茯苓-槐花药对的作用靶点与银屑病的疾病靶点数据分别导入Venny2.1在线作图平台，获取其交集靶点，即为土茯苓-槐花药对治疗银屑病的潜在作用靶点。

1.6 建立蛋白质相互作用系络图（PPI） 将获取的土茯苓-槐花药对与银屑病的交集靶点上传进String数据库中，利用“Multiple Proteins”进行蛋白质相互作用分析，把物种限定为“人类”（Homo sapiens），提交后进行PPI网络图的建立，之后将已建立好的PPI图数据下载并输入Cytoscape3.7.2软件中进行可视化处理，以各靶点基因之间的节点度值（degree）为排列指标，选择PPI网络图中的主要蛋白质，并利用作图工具绘制degree值排前20靶点的水平柱状图。

1.7 构建GO功能富集分析和KEGG通路分析 将药物与疾病的交集靶点信息输入至Metascape平台后进行KEGG以及GO分析，下载其结果并利用微生信在线作图平台进行可视化处理，以研究土茯苓-槐花药对治疗银屑病所相关的生物学进程。

2 结果

2.1 土茯苓-槐花药对活性成分与其作用靶点的筛选 使用TCMSP数据库，分别将土茯苓、槐花为搜索词获取两种中药的有效活性成分，通过筛选标准OB≥30%，DL≥0.18，共获取21个有效活性成分，其中土茯苓15个，槐花6个，合并去除重复值后得到19个活性成分，见表1。然后再次使用TCMSP平台，搜索出这19个活性成分相对应的作用靶点信息，合并去重后一共获得227个靶点信息，将最终的靶点信息利用Uniprot数据库进一步转换为基因名（Gene name）。

表1 土茯苓-槐花药对有效成分信息表

2.2 银屑病相关靶点的筛选结果 使用“Psoriasis”为搜索关键词，高关联性为标准，分别在Genecards、DrugBank、OMIM等疾病数据库中进行检索筛选，得到银屑病靶点个数分别为4 054（根据Genecards中银屑病靶点的相关性评分，以二倍中位数的方法筛选后得到银屑病较为相关的靶点为1 676个[11]）、83、133，筛选后的结果合并且去除重复值后获得1 790个靶点信息。

2.3 药物活性成分-靶点网络图的建立与分析 使用Cytoscape3.7.2软件绘制与分析土茯苓-槐花药对的有效活性成分以及作用靶点信息的网络关系图，共获得248个节点和433条关系，见图1。

图1 土茯苓、槐花药物活性成分-靶点网络图

2.4 土茯苓-槐花药对治疗银屑病的潜在作用靶点将土茯苓-槐花药对的227个作用靶点与银屑病经筛选合并去重后的1 790个疾病靶点数据分别导入Venny2.1在线作图平台制作韦恩图，得到土茯苓-槐花药对治疗银屑病的潜在作用靶点119个，见图2。

图2 土茯苓-槐花治疗银屑病靶点的韦恩图

2.5 土茯苓-槐花药对治疗银屑病关键靶点PPI网络分析 把119个交集靶点输入String数据库中，设定条件后进行蛋白质相互作用分析，从而建立出基础的PPI网络图，然后将建立好的PPI图数据下载并导入Cytoscape3.7.2软件进行可视化处理，图中包括119个节点，2 195条边，节点大小与颜色程度反映靶点的度值（Degree）值大小，节点越大Degree值也越大，代表颜色从浅到深的Degree数值也相应增加，见图3。以各靶点基因之间的节点连接Degree值为排列指标，选择出PPI网络图中的主要核心蛋白质，并利用绘图工具绘制Degree值排前20靶点的水平柱状图，见图4。

图3 土茯苓-槐花与银屑病蛋白质相互作用网络图

2.6 土茯苓-槐花药对治疗银屑病通路富集分析可视化 使用Metascape数据库对119个关键信息节点进行富集分析，其中包括GO功能富集分析的MF（Molecular Function）、BP（Biological Process）、CC（Cellular Component）和KEGG通路分析，然后保存其所得到的结果。依据Log10（P）值的大小，把前20的数据进行可视化处理，把GO分析的MF、BP、CC的结果做成水平柱状图，颜色由红色渐变为蓝色，表示Log10（P）值由小变大，主要节点的数量由横轴表示，见图5。把KEGG通路结果通过微生信在线作图平台用气泡图呈现，图中由红色渐变为绿色说明Log10（P）值由小变大，气泡大小表示此通路富集的基因数量，通路富集基因数量在所有基因中所占比率在横轴表示，见图6。

图5 土茯苓-槐花药对治疗银屑病作用靶点富集条形图

图6 土茯苓-槐花作用靶点的KEGG富集分析通路图

3 讨论

药对是中医学临床治疗常配伍使用的两味药物，由于药物配伍后有效活性成分相互作用，使其药物物质基础发生改变，从而进入人体后在多个靶点经过不同的通路发生协同作用而起到增强药物疗效的作用[12]。虽然药对具有多靶点、多通路、多环节作用的优势，但由于中药复杂的成分、物质基础不明确以及作用机制尚不清楚，如其毒副作用，导致我们无法确定具体有效活性成分，如目标间的相互作用等问题就给中医学治疗疾病带来了一点程度的不确定性[13]。网络药理学是从系统方面解释中药对身体产生调控作用的一门学科，连接了现代药理学与传统中药之间的关系[14]。中药复方以及药对的多成分、多基因、多通路的复杂性更适合应用网络药理学思维去研究。此研究方法为复方或者药对的研究提供了大量的靶点、疾病、化合物等信息，可以从现代药理学方面对以往传统中药方剂的作用机制进行研究分析，极大地为中药新药、新剂型的创造提供思路，也为中医精准治疗疾病提供了数据支持[15]。因此，将中药与网络药理学相结合具有重要的意义。

银屑病是一种丘疹鳞屑型皮肤病，现在此病被认为是最典型的免疫介导的疾病之一。树突状细胞（DC）、抗菌肽（AMPs）、肿瘤坏死因子（TNF）、IL-17、IL-22、IL-23、Th17以及信号转导和转录激活因子（STAT）3与其发病机制有很大关系[16]。中医学对银屑病的认知甚远，目前大多数医者认为有关本病最早出现在隋代《诸病源候论》中“干癣，但有匡郭，枯索，痒，搔之白屑出是也”[17]，后经各个朝代不同医者对此疾病不断探索，对近代银屑病的辨证论治产生了巨大影响。近现代医者在辨证此疾病的时候几乎均以血分论治为主，血热、血燥、血瘀为其基本证型，在治疗中不离开血分也成了各个医者的基本思路，如朱仁康[18]、赵炳南等[19]近代名老中医认为血热是本病发病的主要根源。在现代临床治疗此病时还发现湿邪常与血热夹杂[20]，所以在治疗上常用清热凉血、除湿解毒。土茯苓-槐花药对是中医皮肤科常用药对，具有除湿清热解毒的功用，来源于土槐饮，是中医学治疗银屑病的要药[21]。耿爱爱等[22]用土槐饮加减治疗血热型银屑病，其中对照组与观察组各50例患者，结果观察组总有效率为96%，明显高于对照组84%，说明土槐饮在临床治疗血热型银屑病有很好的疗效。

3.1 药物有效活性成分分析 通过网络药理学的研究方法，一共得到土茯苓-槐花药对治疗银屑病的有效活性成分19个，227个作用靶点。由表1和图1可知，土茯苓-槐花药对治疗银屑病的主要活性成分可能为：槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、柚皮素、异鼠李素以及豆甾醇等。槲皮素是类黄酮的一个特殊子类，是一种强大的抗氧化剂，土茯苓和槐花药物中都含有该成分，研究表明槲皮素具有抗炎、抗氧化、神经保护等作用[23]。槲皮素发挥强大的抗炎作用，主要是经过抑制炎性细胞因子的产生，减少环氧化酶和脂氧合酶的表达，以及维持肥大细胞的稳定性，槲皮素不但可以抑制TNF-α、IL-1β、IL-6等促进炎症物质，还能加快IL-10等抵抗炎症物质的分泌，从而达到对银屑病的治疗效果[24]。山柰酚作为一种多酚，广泛存在于瓜果蔬菜以及中药植物中。其主要通过抑制DNA和髓样分化因子88的NF-κB结合的生物活性，从而来减少IL-6、IL-1β、IL-18和TNF-α的释放，增加Nrf2调节基因的mRNA和蛋白表达，抑制toll样受体4（TLR4）来发挥强大的抗炎作用，还可抑制环氧化酶，防止炎症过程[25]。β-谷甾醇具有多种生物活性，如抗氧化、抗菌和免疫调节活性等。其通过抑制TNF-α、IL-6等炎症因子、抑制淋巴细胞活化和增殖而起到抗炎与免疫调节的作用[26]。柚皮素通过转录和转录后机制抑制炎性细胞因子的产生，其中包含经过制约NF-κB信号通路减低促炎细胞因子如TNF-α、IL-6和IL-1β的产生，以及通过促进溶酶体介导的细胞因子降解，抑制细胞因子释放，从而减轻炎症反应[27]。药理研究表明抑制NF-κB通路是异鼠李素的主要抗炎机制，炎症反应各个环节的很多物质都经NF-κB调节，包括TNF-α、多种IL、iNOS、COX2、趋化和集落刺激因子以及黏附分子等。异鼠李素也可能是一种有效的免疫抑制剂，它可以抑制树突细胞的活化和运输，从而减少炎症反应[28]。豆甾醇被广泛地认为是一个具有免疫调节功能的天然类固醇，它还具有抗炎的作用，通过制约免疫球蛋白E（IgE）所导致的皮肤过敏反应，来降低炎性细胞的浸润以及皮损的增厚，对治疗银屑病有很大的作用[29]。

3.2 关键靶点结果分析 土茯苓-槐花药对与银屑病共有119个潜在关键靶点，依据Degree值的大小进行排名，其中较为重要的靶点分别为：TNF、IL-6、肿瘤蛋白P53（TP53）、IL-1β、血管内皮生长因子A（VEGFA）等。TNF是几种慢性炎性疾病（包括银屑病和与银屑病相关的其他共病）发病机制中的关键细胞因子，其可以活化角质形成细胞从而产生其他炎性介质。而且，血清或血浆中TNF-α水平升高被认为是银屑病的生物标志物，所以，它被广泛认为是抗银屑病治疗的重要靶点[30]。IL-6在银屑病患者中主要由内皮细胞以及树突状细胞产生，它促进银屑病发生发展的机制主要是通过导致具有免疫调节作用的调节性T细胞丢失，从而影响Th17细胞与Treg细胞的平衡状态实现的[31]。IL-1β可以刺激角质形成细胞分泌趋化因子，从而化学吸引更多能够从外周产生细胞的IL-17，建立起扩增的炎性反应，导致银屑病等皮肤炎症发病[32]。VEGFA是主要的促血管生成因子，在银屑病患者皮肤中过表达，并与疾病严重程度相关。VEGFA在银屑病中的作用是通过VEGFA基因组位于银屑病易感位点之一PSORS1附近以及VEGFA单核苷酸多态性与银屑病严重程度的相关性得到的[33]。

3.3 通路与生物进程分析 对土茯苓-槐花与银屑病的共同靶点信息进行KEGG通路富集分析，土茯苓-槐花药对治疗银屑病主要涉及以下几条通路：PI3KAkt、AGE-RAGE、MAPK、IL-17、TNF等信号通路。根据研究表明，PI3K-Akt信号通路是细胞生长、增殖、存活、细胞凋亡抑制、脂肪生成抑制等过程中至关重要的信号转导途径。对于皮肤而言，该信号通路对角质形成细胞、真皮纤维细胞、毛囊干细胞等的存活、生长、增殖、再生和凋亡至关重要，并且能维护它们的功能[34]。PI3K-Akt-mTOR途径在银屑病患者皮损中高度表达，银屑病患者体内PI3K与Akt结合，从而反过来激活mTOR以促进角质细胞过度增殖并抑制分化。据报道，细胞因子和生长因子如IL-17和IL-12的失调可激活mTOR途径，这是调节银屑病增生和炎症过程的必要因素。据报道PI3K-Akt-mTOR信号通路在Th1/Th2/Th17失衡中起作用，这是银屑病发生和发展的关键，因此PI3K-Akt信号通路被认为是银屑病的发病机制，有望成为一个有前途的抗银屑病靶点[35]。据研究表明，糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路可能是导致银屑病发病的机制之一，银屑病体内炎性因子的升高，会引起机体代谢异常、胰岛素抵抗等各种进程，因此通过抑制该通路便可抑制炎性因子的产生，从而起到治疗银屑病的作用[36]。有研究表明，MAPK信号通路的过度激活对银屑病患者体内炎性因子的产生有着促进作用[37]。T细胞来源的IL-17可以激活多种细胞，包括类风湿性关节炎滑膜细胞、成纤维细胞和角质形成细胞，释放细胞因子和趋化因子，促进炎症，IL-17途径的失调使自身免疫性和炎症性疾病中的慢性炎症持续存在，如银屑病。银屑病被认为是在遗传易感个体对特定自身抗原失去T细胞耐受性时引发的。这可能发生在环境损伤激活先天免疫细胞的情况下。例如，当与抗微生物肽LL-37复合时，受损细胞释放的DNA通过TLR-9激活浆细胞样树突细胞（pDC）产生IFN-α，并允许DC向T细胞呈递LL-37自身抗原.然后这些T细胞在特异性极化细胞因子的影响下分化成Th1和Th17细胞亚群。Th17细胞产生IL-17A、IL-17F和IL-22，它们单独或与TNF一起有效激活角质形成细胞。这些角质细胞然后分泌抗微生物肽、细胞因子和趋化因子，招募和激活免疫细胞，导致持续炎症的反馈循环，因此抗IL-17疗法在银屑病中的治疗中有很重要的作用[38]。研究表明，TNF是一种关键的促炎和免疫调节细胞因子，其失调与自身免疫性疾病和其他病理的发展有关，TNF-α信号通路是导致银屑病发生发展的主要通路之一，而且在治疗银屑病患者时使用抗TNF-α的生物制剂也得到了良好的效果[39]。

综上所述，本研究经过网络药理学方法发现了土茯苓-槐花药对治疗银屑病的主要活性成分可能是槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、柚皮素、异鼠李素、豆甾醇等，而发生作用的重要信号通路可能有PI3K-Akt、AGE-RAGE、MAPK、IL-17、TNF等。这也反映了土茯苓-槐花药对治疗银屑病是通过多个活性成分、多种作用靶点、多种通道的化学过程进行的，这为更加明确土茯苓-槐花药对对治疗银屑病的作用机制奠定了理论学习基础。但鉴于本研究的局限，将来应经过更多的实验和数据来证实土茯苓-槐花治疗银屑病的重要靶点信息及信号通路。