阴阳双补方治疗骨转移癌作用机制探讨*

杨梦霞 芦殿荣 朱世杰 周 磊

（1.中国中医科学院望京医院，北京 100102；2.北京中医药大学，北京 100029）

骨骼是肿瘤细胞转移最主要的目标器官之一，转移率仅次于肺和肝[1]。约2/3晚期恶性肿瘤患者会发生骨转移[2]，在临床上主要表现为局部持续性进行性刺痛和明显的压痛、病理性骨折、椎体转移的脊髓压迫、高血钙等，严重影响了患者一般机体状况和生活质量，缩短生存期[3]。目前西医多采用放疗、手术及药物治疗等姑息疗法，但临床应用局限且存在许多不良事件，如：骨折、低血钙症和颌骨坏死等[4]。近年来，中医药在改善肿瘤患者生活质量、缓解临床症状、延长生存期等方面具有显著优势，且疗效明确，不良反应少[5]。历代中医学者认为肿瘤骨转移多是肾精亏虚、骨失濡养所致。本研究团队通过总结全国名老中医李佩文教授临床用药经验发现，归肾经方——阴阳双补方对骨转移防治具有较好的临床疗效，但其作用机制尚未清楚。故本研究拟基于网络药理学方法初步探讨阴阳双补方治疗骨转移癌的理论内涵，以便为今后临床用药提供更多参考依据。

1 材料与方法

1.1 阴阳双补方主要有效成分筛选 在中药数据库TCMSP（http：//lsp.Nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）中检索阴阳双补方（由补骨脂、骨碎补、肉苁蓉、淫羊藿、透骨草、山茱萸、山药、熟地黄组成）有效成分，保留OB≥30%且DL≥0.18的成分；同时，借助TCMID（http：//www.mega-bionet.org/tcmid/）及TCM Database@Taiwan（http：//tcm.cmu.edu.tw/）中药数据库对检索不到有效成分的药物进行补充。

1.2 阴阳双补方潜在靶点预测 在PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中检索阴阳双补方主要有效成分所对应的化学结构，并在Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）中，以“Homo sapiens”为检索条件，保留“Probability＞0.1”的潜在靶点；最后使用Cytoscape3.8.2中的MCODE（Version1.4.2，Bader Lab，University of Toronto）插件，筛选出重要模块基因并进行可视化分析。

1.3 骨转移癌疾病基因筛选 在Drugbank（http：//www.drugbank.ca/）和DisGeNet（http：//www.disgenet.org/）疾病基因数据库中，查询骨转移癌疾病基因，并在Uniprot（https：//www.uniprot.org/）数据库中将基因标准化。

1.4 阴阳双补方针对骨转移癌的潜在治疗靶点预测 通过韦恩映射筛选出潜在治疗靶点，同时使用STRING11.5（https：//string-db.org/）数据库构建基因功能关联网络，并在Cytoscape3.8.2中可视化，同时利用MCODE插件筛选出核心靶点。

1.5 潜在治疗靶点功能分析 使用DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）分别对潜在治疗靶点进行GO及KEGG通路富集分析，并将结果可视化（FDR＜0.05）。

2 结果

2.1 阴阳双补方主要有效成分 在中药数据库中检索到阴阳双补方主要有效成分共88个（补骨脂4个、骨碎补17个、肉苁蓉6个、淫羊藿23个、透骨草7个、山茱萸肉14个、山药15个、熟地黄2个），见表1（仅列出每位药OB值排名前5的有效成分）。

表1 阴阳双补方主要有效成分

2.2 阴阳双补方潜在靶点 在Swiss Target Prediction中检索到阴阳双补方共包含673个靶点。将这些靶点在Cytoscape3.8.2中使用MCODE插件筛选重要模块靶点，发现这些靶点主要位于模块A（得分为29.568，含36个节点，547条边）和B（得分为17.017，含58个节点，502条边），见图1。

图1 阴阳双补方潜在靶点重要模块基因

2.3 阴阳双补方针对骨转移癌的潜在治疗靶点 在疾病基因数据库中检索到骨转移癌疾病基因有773个，与673个药物潜在靶点进行韦恩映射，得到150个潜在治疗靶点，见图2。在STRING11.5数据库中构建蛋白-蛋白互作网络，并在Cytoscape3.8.2中可视化，包含145个节点，1 531条边，见图3A；并使用MCODE插件筛选核心靶点，取节点连接度排名前20的靶点做条形图，见图3B。

图2 阴阳双补方潜在靶点和骨转移癌疾病基因的韦恩图

图3 阴阳双补方治疗骨转移癌的潜在靶点（A）及核心靶点（B）

2.4 潜在治疗靶点的GO功能分析 对150个潜在治疗靶点进行GO功能富集分析，根据“FDR＜0.05”筛选得到BP48个、CC9个和MF30个。分别取BP、MF排名前10的条目及9项CC进行可视化，见图4。在BP方面，包括蛋白质自磷酸化、肽基酪氨酸磷酸化及磷脂酰肌醇介导的信号转导等；在CC中，涉及树突、磷脂酰肌醇3-激酶复合物及溶酶体等；在MF方面，涉及跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性、神经递质受体活性及磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶活性等。

图4 阴阳双补方治疗骨转移癌潜在靶点的GO功能富集分析

2.5 潜在治疗靶点的KEGG功能分析 对150个潜在治疗靶点进行KEGG通路富集分析，得到97条通路，根据“FDR＜0.05”筛选得到82条通路，将前30条通路进行可视化，见图5。相关通路主要有HIF-1、Rap1、VEGF、PI3K-Akt及mTOR等信号通路。

图5 阴阳双补方治疗骨转移癌潜在靶点的KEGG通路富集分析

3 讨论

现代医学认为，肿瘤细胞在趋化作用下可改造骨微环境，而骨微环境也在不断招募肿瘤细胞，进而使肿瘤细胞向骨组织定植[6]。中医学认为肾主骨生髓，故骨转移患者多从肾论治。本研究团队根据李老治疗骨转移临床用药经验，选取常用补肾类中药加减化裁组成“阴阳双补方”，方中补骨脂、骨碎补补肾助阳，肉苁蓉补肾温阳，益精血，3药相辅相成，培补肾中元阳，共为君药；熟地黄滋补肾精，山茱萸肉、山药养肝补脾，俱为臣药；淫羊藿、透骨草益肾强骨，两药合用，助君药温壮肾阳之功；诸药合用，补肾之中兼顾养肝益脾，使肾精得充而虚损易复；温阳之中参以滋阴填精，则阳得阴助而生化无穷，诸药合用，共奏补肾助阳、益精填髓之效，但作用机制尚未清楚。

本研究通过筛选“阴阳双补方”主要有效成分，并构建其与相关靶点相互作用网络图，发现β-谷甾醇、山柰酚、槲皮素及淫羊藿苷等为其核心化合物。其中β-谷甾醇一方面可通过清除活性氧诱导结肠癌细胞凋亡，另一方面可抑制人结肠癌细胞中β-连环蛋白和PCNA抗原的表达，进而抑制癌细胞生长[7]。山柰酚可抑制中性粒细胞释放中性粒细胞胞外陷阱，进而抑制癌细胞转移，此外也可激活MAPK信号和MMP信号[8]。槲皮素可抑制甲状旁腺激素受体1活性，阻碍其与甲状旁腺激素和甲状旁腺激素相关肽的结合，进而降低人转移性骨肉瘤细胞的侵袭、黏附、增殖和迁移率[9]。淫羊藿苷具有抑制血管生成和肿瘤转移的作用，其作用机制主要是通过降低肝癌细胞中VEGF和APRIL的表达水平以抑制内皮细胞迁移[10]。

通过Cytoscape3.8.2软件构建“阴阳双补方”治疗骨转移癌的功能关联网络，发现EGFR、CASP3、STAT3、AKT1、ERBB2及MMP2/9。其中EGFR在促进多种肿瘤的发生和转移中有重要作用，研究认为可溶性因子可通过旁分泌机制激活邻近成骨细胞中的EGFR通路，并下调OPG表达，RANKL和OPG比例增加有利于破骨细胞的生成，并导致溶骨性骨转移的恶性循环[11]。CASP3通常被认为是细胞凋亡的标志，其活性增加可促进应激诱导的癌细胞生长、细胞迁移、侵袭性和肿瘤血管生成[12]。STAT3是一种转录因子，通过JAK-STAT3信号通路在肿瘤细胞增殖、存活、侵袭和免疫抑制中有重要作用，还可通过炎症、干细胞和转移前生态位促进癌症发生[13]。ERBB2可在癌症干细胞中选择性表达，并且在胫骨中的表达水平更高，这可能是通过RANKL激活RANK受体介导的[14]。AKT1基因是原癌基因，其相应的蛋白质可调节PI3K信号转导途径下游的事件，并在抑制细胞活力、增殖、分化和凋亡中起重要作用[15]。MMP2/9均为癌相关性内肽酶，在调节细胞生长、侵袭、迁移、血管生成和炎症的一些关键信号通路中发挥关键作用[16]。

通过DAVID数据库富集分析发现，阴阳双补方治疗骨转移癌的作用机制主要涉及抑制癌细胞转移、促细胞凋亡及调节骨微环境等多个环节。其中HIF信号通路是肿瘤微环境的重要组成部分，当局部缺氧和成骨细胞中缺氧时HIF-1α可被激活，这对维持骨骼内环境平衡至关重要[17]。研究发现骨祖细胞位于骨髓中的低氧环境中，当骨祖细胞中HIF信号激活可增加趋化因子CXCL12的血液水平，进而直接激活CXCR4受体导致乳腺癌细胞增殖和扩散的系统性增加[18]。Rap1信号传导涉及不同癌症细胞增殖和迁移的调节，研究显示Rap1GAP的逆转录病毒沉默可极大程度增强ERK/MAPK的磷酸化和活化，诱导广泛的细胞骨架重组和EMT特征的表达，并增强乳腺导管原位癌细胞的侵袭[19]。VEGF可通过结合内皮细胞上的VEGFR1/2影响肿瘤微环境，其旁分泌机制大大增加了肿瘤血管的数量和大小，以提供充足的血液供应[20]。研究发现在各种肿瘤组织中，VEGF通过自分泌作用与分泌VEGF的肿瘤细胞上的VEGF受体结合，这种分泌反应导致不同信号转导途径的激活，并最终支持肿瘤的生长和增殖[21]。PI3K/Akt通路中相关蛋白表达可影响胃癌细胞转移及侵袭能力，可能用于预测患者术后骨转移的发生[22]。mTOR是PI3K/Akt通路下游的一个蛋白，在该通路活化后可增加磷酸化产物水平，进而介导下游重要信号分子，促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭过程，抑制凋亡[23]。

综上所述，从网络药理学角度分析可发现，阴阳双补方主要有效成分如：β-谷甾醇、山柰酚、槲皮素及淫羊藿苷等可通过EGFR、CASP3、STAT3、AKT1、ERBB2及MMP2/9等靶点调控HIF-1、Rap1、VEGF、PI3K-Akt及mTOR等信号通路，进而发挥抑制癌细胞转移、促凋亡及调节骨微环境等作用，这对未来临床用药及本团队后期基础研究方向都有一定参考价值。