8 种香辛料抑菌效果比较及丁香抑菌机理分析

米 婷 冯 艳 苑本玲 王 婷 李雪莉 张晓娟，2*

（1.成都师范学院化学与生命科学学院，四川 成都 611130；2.成都师范学院食品发酵研究所，四川 成都 611130）

食品防腐剂主要通过对微生物细胞亚结构产生不利影响来达到抑制其生长的目的，可被分为化学合成防腐剂与天然防腐剂，前者作用效果佳 ，但大多具有富集作用以及潜在的致畸致癌性。天然香辛料是一类芳香植物的根、茎、叶、果实或花蕾等，不仅具有提香、赋味、增进食欲的功能，且在食品抑菌防腐方面，具低毒副作用、抗菌谱广、易获取、无污染、不易产生耐药性等优点。

本文选用8 种食用香辛料，对抑菌活性进行比较，并进行抑菌机理分析，为天然香辛料在食品防腐保鲜中的开发利用提供理论支持。

1.材料与方法

1.1 材料与仪器

香辛料：大蒜、丁香、花椒、肉桂均购于四川省成都市温江区红旗连锁超市；白芍购于四川省成都市箐山地道无硫食材店；千佛竹根姜购于四川省阆中市菜市场。

主要培养基：牛肉膏蛋白胨培养基、LB 培养基。

实验试剂：碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）测定试剂盒，北京索莱宝科技有限公司。

旋转蒸发器RE-52 上海亚荣生化仪器厂；循环水式多用真空泵SHB-III 型 苏州江东精密仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 香辛料提取物的制备

香辛料提取物制备流程如下：

粉碎→浸泡→超声波提取→离心→真空抽滤→旋转蒸发浓缩→原液

减压抽滤后用旋转蒸发仪进行浓缩，密封后保存于4℃冰箱中备用。

1.2.2 香辛料的抑菌活性比较

将已活化的菌种用生理盐水稀释制成 1×106 CFU/mL 菌悬液。牛津杯内加入200 µL 不同香辛料提取物，放入37 ℃恒温培养箱中培养24 h，以无菌水作阴性对照，以30%H2O2作阳性对照。

1.2.3 最小抑菌浓度（MIC）的测定

以大肠杆菌为指示菌，按文献方法进行MIC 的测定。

1.2.4 丁香提取物对大肠杆菌细胞膜通透性的影响

1.2.4.1 丁香提取物对大肠杆菌培养液总漏出率的影响

将大肠杆菌悬浮于 5 %葡萄糖溶液中，取 8.44 mL，加入丁香提取原液1.56mL，置于恒温摇床中培养7.5 h，每隔1.5 h，取菌悬液，3000 r/min 下离心8 min，用紫外分光光度计在600 nm 波长下测上清液的吸光值，试验重复3 次。对照组不加丁香提取液。

1.2.4.2 丁香提取物对大肠杆菌细胞膜的损害程度

取 大 肠 杆 菌 LB 培 养 液20 ml，4800 rpm 下 离 心10 min，弃去LB 培养基，用磷酸盐缓冲液洗涤一次，再悬浮于0.02 mol/L、pH 6.6 磷酸盐缓冲液中，使重悬液在600 nm 下吸光度约为0.65。丁香提取液加入大肠杆菌重悬液中，使丁香提取物的终浓度为5 MIC。置于37℃摇床中培养，间隔45 min 取菌悬液测定260 nm处的吸光度。阴性对照为不添加丁香提取物的磷酸缓冲重悬液，试验重复3次。

式中:为含有丁香提取液的试验组在各取样时间点的OD 值;为含有丁香提取液的试验组在0 h 时的OD 值;为阴性对照组在各取样时间点的OD 值。

1.2.5 丁香提取物对大肠杆菌细胞壁的影响

每隔1.5 h，4800 r/min 离心10 min 收集上清液。 根据碱性磷酸酶(AKP) 测定试剂盒的方法步骤测定胞外AKP活性。

2.结果与分析

2.1 8 种香辛料的抑菌效果比较

由表1 所示，大蒜、丁香、白芍、肉桂的抑菌效果较优：丁香对大肠杆菌的抑制作用最强，DIZ 达23.33±0.29 mm；白胡椒、竹根姜、花椒和辣椒的抑菌强度相对较弱。

表1 8种香辛料对E．coli的抑菌圈（DIZ）大小

2.2 最小抑菌浓度（MIC）的测定

选取抑菌效果较好的丁香、肉桂、大蒜、白芍进行MIC 的测定。由图1 可得，4 种供试香辛料中，丁香对大肠杆菌的抑制效果最好，MIC 为3.125 mg/ml。

图1 香辛料对大肠杆菌的最小抑制浓度

2.3 丁香提取物对大肠杆菌细胞膜通透性的影响

2.3.1 丁香提取物对大肠杆菌培养液总漏出率的影响

如图2 所示，对照组大肠杆菌总漏出率随时间延长有增加趋势，但幅度较小；而丁香提取物处理的对照组，大肠杆菌总漏出率与时间呈正相关，且增幅较对照组显著，丁香醇提物可破坏细胞膜的通透性，表现为胞内在600 nm 有特征吸收的小分子物质外漏。

图2 丁香提取物对E．coli总漏出率的影响

2.3.2 丁香提取物对大肠杆菌细胞膜的损害程度

胞内的核酸物质在260 nm 下有特征吸收，通过测定上清液在260 nm 下的吸光度，运用式ξ 计算得到的比值越大，表明核酸物质泄漏量越大，即细胞膜的损伤程度越大。由图3 可得，丁香提取物对大肠杆菌细胞膜有一定程度的损害，且其损害程度随时间延长而增加，但总体而言，损害性较轻微。

图3 丁香提取物对E．coli细胞膜的损害程度

如表2 所示，经丁香提取液处理7.5h 后，大肠杆菌总漏出率与对照组的差异显著，其为对照组的5.54 倍；经丁香提取液处理3h 后， 大肠杆菌核酸大分子溶出量是对照组的1.27倍，对照组与处理组之间具有差异的显著性。

表2 丁香提取液处理后对大肠杆菌胞内物的影响

丁香提取物处理后，大肠杆菌菌体细胞膜受到了一定程度的破坏，细胞膜通透性增加，进而导致部分内含物流出、菌体细胞的生长代谢紊乱，最终抑制细胞生长。

2.4 丁香提取物对大肠杆菌细胞壁的影响

从表3 可得，经丁香提取液处理7.5 h 后，胞外AKP活力是对照组的8.11 倍，具差异的显著性；如图4 所示，试验组的胞外AKP 活力与时间正相关，伴随时间的延长，AKP 活力增强；未经过丁香提取物处理的对照组，其上清液AKP 活性较低且趋于稳定。由此推之，丁香提取物处理后，大肠杆菌的细胞壁受到了破坏。

图4 E．coli胞外AKP酶活力的变化

表3 丁香提取液处理后对E．coli 胞外AKP活力的影响

3.结论

8 种四川香辛料对大肠杆菌均有不同程度抑制活性，其中大蒜、丁香、白芍、肉桂的抑菌效果更明显：丁香对E.coli 的抑制作用最强，DIZ 达23.33±0.29 mm；肉桂和大蒜次之，其DIZ 分别达21.67±0.29 mm、21.33±0.29 mm；白芍对大肠杆菌的DIZ 为15.73±0.25 mm。白胡椒、竹根姜、花椒和辣椒的抑菌强度相对较弱，抑菌直径为9.17±0.17 ～13.17±0.29 mm。

经5 MIC丁香提取液处理7.5 h后，大肠杆菌总漏出率、胞外AKP 活力与对照组相比均有显著差异，分别增加了5.54 倍、8.11 倍；经5 MIC 丁香提取液处理3 h 后， 大肠杆菌核酸大分子溶出量是对照组的1.27 倍，对照组与处理组之间具有差异的显著性，丁香提取物能破坏大肠杆菌细胞膜。