Let-7a-5p靶向整合素αV调节气道平滑肌细胞转化生长因子β1表达和活化*

闻康，郭佳，倪凯，杨崇鑫，罗明志，邓林红

(常州大学药学院&医学院(筹)，生物医学工程与健康科学研究院，常州 213164)

引言

气道炎症是多种呼吸系统疾病如哮喘、慢性阻塞性肺部疾病，以及病毒感染疾病如新型冠状病毒等的重要病理机制，甚至可能引起急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrme, ARDS)[1]。气道炎症的发生、发展受多种细胞内外信号分子的调节，包括微小RNA(microRNA, miRNA)。miRNA是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，可以通过5′端的种子序列与位于靶基因mRNA 3′端非编码区(UTR)靶点结合而发挥生物效应，参与细胞行为调控[2]。Let-7家族是肺中最丰富的miRNA，其中let-7a-5p被报道为可以调节炎症反应和细胞表型的重要因子[3]，但let-7a-5p参与调控气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells, ASMCs)炎症因子分泌表型的作用及其机制尚不清楚。

气道炎症的产生细胞包括免疫细胞和气道结构性细胞，如ASMCs。ASMCs不仅具有收缩功能，同时还具有分泌表型，可分泌转化生长因子β1(transformation growth factor β1, TGFβ1)、白介素等参与气道结构和功能调控[4]。其中，ASMCs的分泌功能受到整合素信号的调控。整合素是一类由两条跨膜多肽链α和β以非共价方式结合而成的异二聚体跨膜黏蛋白，主要介导细胞与细胞之间，及细胞与细胞外基质之间的黏附，从而参与炎症反应过程[5]，已有多种靶向整合素的药物被开发。研究发现miR-222可以靶向整合素β8调节小胶质细胞炎症因子的分泌[6]。而整合素αVβ6、αVβ8被报道可以促进TGFβ1的活化[7-8]。虽然ASMCs高表达let-7a-5p，但不清楚let-7a-5p是否通过靶向整合素调控ASMCs的TGFβ1的表达和活化。

1 材料和方法

1.1 细胞系、质粒和试剂

HEK293T、ASMCs(北纳生物)；DMEM培养基、胎牛血清、青霉素链霉素和胰蛋白酶(美国ThermoFisher公司)；细胞培养瓶和培养板(美国康宁公司)；96孔白板、Dual-LumiTM双荧光素酶报告基因检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)。PCR引物、qPCR引物、let-7a-5p模拟物和抑制剂及正常对照序列(安徽通用生物技术有限公司)；转染试剂lipofectamine 3000(Invitrogen公司)；psiCHECK-2双荧光素酶质粒(优宝生物)；感受态细胞(上海生工生物工程有限公司)；DNA提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；限制性内切酶XhoI和NotI、DNA聚合酶、dNTP(ENB)；T4 DNA连接酶(TaKaRa公司)；PCR产物回收试剂盒、质粒提取试剂盒(OMEGA公司)；cDNA逆转录试剂盒以及SYBR染料(vazyme公司)；TGFβ1 ELISA试剂盒(碧云天公司)；除非另有说明，所有其他试剂均购自ThermoFisher公司。

1.2 细胞培养

HEK293T培养于含10 % 胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的DMEM高糖培养液，置于含5% CO2混合气体的37℃培养箱，实验用对数生长期细胞。

ASMCs贴壁培养于含10 % 胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的DMEM低糖培养液中，置于含5 % CO2混合气体的37℃培养箱，实验用对数生长期细胞。

1.3 生物信息学预测let-7a-5p靶基因

以let-7a-5p作为检索词分别在Starbase、miRmap、miRwalk数据库检索，搜索与let-7a-5p相互作用的靶基因。

1.4 双荧光素酶报告载体的构建

从NCBI数据库调取ITGAV基因3′-UTR段的碱基序列(NM_001144999)后，采用Primer 5.0软件设计PCR引物，引物由安徽通用生物公司合成。

ITGAV基因3′-UTR序列、ITGAV PCR前后引物序列、let-7a-5p序列、let-7a-5p模拟物和抑制剂及其正常对照的序列信息，见表1。ITGAV PCR前后引物序列的加黑体分别为XhoI，NotI酶切位点序列，之前序列为保护碱基，引物扩增长度为102 bp。

表1 人ITGAV基因3′UTR序列、ITGAV PCR前后引物序列、let-7a-5p序列、let-7a-5p模拟物及其正常对照的序列Table 1 Sequences of 3′UTR of human ITGAV gene, primer sequences before and after ITGAV PCR, let-7a-5p sequence, let-7a-5p mimic and normal control

以HEK293T细胞基因组cDNA为模板，进行PCR扩增，反应体系为50 μL体系：2 × Phanta Max Buffer 25 μL；dNTPMix (10 mM) 1 μL；上下游引物 (10 μM) 各2 μL；cDNA 5 μL；Phanpta Max Super-Fidelity DNA polymerase 1 μL；加水至50 μL。反应条件为：95℃预变性5 min，95℃变性15 s，之后56 ℃退火15 s，72℃延伸30 s，共35个循环；72℃继续延伸5 min，然后4℃保存。PCR反应完取2 μL产物进行1 %琼脂糖电泳分析。按照凝胶纯化试剂盒说明书进行纯化产物后，用XhoI、NotI对上述PCR产物和载体进行双酶切，采用T4 DNA连接酶将双荧光素酶报告载体 (psiCHECK-2) 与ITGAV基因3′-UTR片段相连，反应体系是PCR产物与荧光素酶报告载体以3∶1比例混合，图1为psiCHECK-2载体结构图谱。取连接反应产物100 μL加入转化感受态DH5a，涂布平板并单克隆挑菌，扩增之后提取质粒，单酶切和双酶切后，用琼脂糖凝胶验证正确，再将重组双荧光素酶报告载体测序鉴定(安徽通用生物系统有限公司)。测序鉴定正确的重组载体命名为psiCHECK-2-ITGAV-3′-UTR。

比较典型者，如朱权在对元曲进行风格分类时，其“新定府体一十五家”冠以诸如“承安体(华观伟丽)”“西江体(文采焕然，风流儒雅)”[11](P13-14)这类的评价，反映出他对元曲艺术成就的高度认同。

图1 psiCHECK-2载体结构图谱Fig.1 Structural mapping of psiCHECK-2 vector

1.5 双荧光素酶活性测定

首先采用脂质体瞬时转染相应模拟物及对照和质粒进入HEK293T细胞。HEK293T细胞种至96孔白板中，每孔细胞约3×104个，转染前换成无血清DMEM培养基80 μL。细胞瞬时转染采用lipofectamine 3000转染试剂，操作方法遵循说明书进行。按照每孔let-7a-5p模拟物或let-7a-5p模拟物正常对照50 nM，加到含5 μL Opti-DMEM培养基的EP管中，重组质粒或空白质粒0.2 μg，加到含0.2 μL P3000和5 μL Opti-DMEM培养基的EP管中，同时另取一EP管，取0.4 μL脂质体加到5 μL Opti-DMEM培养基中，混匀，室温孵育5 min。将上一步中的两者混匀，室温孵育20 min。将转染复合物加到96白板中，模拟物和质粒各10 μL/孔,12 h后换成完全培养基。具体实验分组如下：(1)共转染psiCHECK-2-ITGAV-3′-UTR和模拟物正常对照组；(2)共转染psiCHECK-2-ITGAV-3′-UTR和let-7a-5p模拟物组；(3)共转染psiCHECK-2空白质粒和let-7a-5p模拟物组。上述实验每组设4个平行孔，每组实验重复3次，转染48 h检测萤光素酶强度。

萤光素酶检测的具体方法如下：取出细胞培养板在室温平衡10 min，96孔板每孔加入100 μL Dual-LumiTM萤火虫萤光素酶检测试剂，混匀。室温(约25℃)孵育10 min，使发光信号趋于稳定。使用具有检测化学发光功能的多功能酶标仪进行化学发光检测。之后，96孔板每孔加入100 μL Dual-LumiTM海肾萤光素酶检测工作液，混匀。室温(约25℃)孵育10 min，使发光信号趋于稳定。使用多功能酶标仪进行化学发光检测。在以萤火虫萤光素酶为内参的情况下，用海肾萤光素酶测定得到的RLU值除以萤火虫萤光素酶测定得到的RLU值。根据得到的比值来比较不同样品间报告基因的激活程度。

1.6 ASMCs胞内mRNA表达、胞外TGFβ1含量检测

采用qPCR检测细胞内ITGAV、TGFβ1的mRNA表达方法如下(qPCR相关引物序列见表2)：ASMCs种至12孔板后，转染50 nM let-7a-5p模拟物和抑制剂以及正常对照，转染48 h后提取总RNA。按照逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录成cDNA。以ASMCs细胞基因组cDNA为模板，进行qPCR扩增，反应体系为10 μL体系：cDNA 1 μL；前后引物 (10 mM/个) 各0.4 μL；SYBR染料5 μL；之后加DEPC水至10 μL。反应条件为：95℃预变性5 min，95℃变性10 s，之后56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环。

表2 qPCR相关引物序列Table 2 Related primer sequences of qPCR

采用Elisa检测ASMCs 胞外TGFβ1分泌量方法如下：ASMCs种至12孔板后，转染let-7a-5p模拟物和抑制剂以及正常对照，转染48 h，之后采用Elisa试剂盒测上清液中TGFβ1量。

1.7 统计学处理

采用SPSS统计软件，所有数据以平均值±标准偏差表示，进行t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Let-7a-5p靶向分子的生物学信息学预测结果

生物信息学预测结果显示，整合素家族中存在let-7a-5p靶基因，见表3。对多个网站结果作交集后，发现let-7a-5p与ITGAV、ITGB3基因3′-UTR存在互补结合位点。鉴于已有文献报道let-7a-5p可以靶向ITGB3[9]，本研究重点探究let-7a-5p是否可以靶向ITGAV。

表3 生物信息学预测let-7a-5p的整合素相关靶基因Table 3 Bioinformatics analysis predicts integrin-related target genes for let-7a-5p

2.2 psiCHECK-2-ITGAV-3′-UTR双荧光素酶报告基因载体的构建

为验证let-7a-5p是否靶向ITGAV，构建含ITGAV基因3′-UTR双荧光素酶报告基因载体。首先使用PCR方法，扩增得到ITGAV基因3′-UTR序列(含let-7a-5p结合位点)，见图2(a)。使用琼脂糖电泳鉴定，结果显示，其长度与数据库中提供的一致，约为102 bp，见图2(b)。将该片段经Xhol、NotI双酶切后插入线性化的psiCHECK-2载体，然后将其转化进DH5α感受态细胞。随机单克隆挑菌培养，提取质粒，再用Xhol和NotI单酶切和双酶切鉴定，证实左边双酶切和右边单酶切后得到的基因片段与预期大小相符，经单酶和双酶消化的重组载体的琼脂糖电泳图，见图2(c)。将重组载体进行测序，测序结果见图2(d)。正向及反向测序图显示，重组载体中的ITGAV基因3′-UTR序列与PCR产物长度完全一致，并与ITGAV基因的CDS序列相同，故将该报告重组载体命名为psiCHECK-2-ITGAV-3′-UTR。

图2 psiCHECK-2-ITGAV双荧光素酶报告基因载体的构建Fig.2 Construction of psiCHECK-2-ITGAV dual luciferase reporter gene vector

2.3 Let-7a-5p靶向ITGAV双荧光素酶报告基因和ASMCs表达验证

将构建成功的双荧光素酶报告载体psiCHECK-2-ITGAV-3′-UT转染HEK239T细胞，转染let-7a-5p模拟物和对照组后检测荧光素酶活性，结果显示，与对照组相比，let-7a-5p模拟物显著降低荧光素酶活性(下调约22 %，P<0.01)。而let-7a-5p模拟物加空白质粒组无显著影响(0.93±0.01)，见图3(a)。该结果显示，let-7a-5p可以降低含ITGAV基因3′-UTR的报告基因的活性，提示其可以和ITGAV基因3′-UTR结合。

为确认let-7a-5p调控ASMCs细胞ITGAV表达，在ASMCs细胞转染let-7a-5p模拟物和抑制剂后，采用qPCR检测细胞内let-7a-5p和ITGAV的表达，结果显示，可以显著增加和降低细胞内let-7a-5p的表达量，并降低和增加细胞内ITGAV的mRNA表达，见图3(b)。该实验结果表明，let-7a-5p转染成功后在ASMCs细胞内可以和ITGAV基因的3′-UTR结合，从而降低ITGAV表达。

注：**P<0.01。

2.4 Let-7a-5p调节ASMCs TGFβ1的表达和活化

ASMCs转染let-7a-5p模拟物和抑制剂后，分别检测细胞内TGFβ1的mRNA表达和细胞外TGFβ1的分泌量。ASMCs细胞转染let-7a-5p模拟物、抑制剂及相应对照物后检测细胞内TGFβ1 mRNA的表达，见图4(a)；let-7a-5p模拟物和抑制剂对ASMC细胞外TGFβ1分泌的影响，见图4(b)。结果发现，模拟物降低细胞内TGFβ1的mRNA表达(0.72±0.08)。但检测细胞外分泌TGFβ1的含量发现，模拟物组细胞外TGFβ1的分泌量显著增加(1.16±0.06)，表明let-7a-5p虽然降低细胞内TGFβ1的mRNA 表达，但可能增加细胞外基质中TGFβ1的活化。

图4 Let-7a-5p调控ASMCs胞内ITGAV的表达和细胞外基质TGFβ1的活化Fig.4 Let-7a-5p regulates intracellular ITGAV mRNA expression and extracellular matrix TGFβ1 activation in ASMCs

3 讨论

本研究首先经生物信息学方法预测let-7a-5p靶基因，构建含靶向基因3′-UTR段的双荧光素酶报告载体，验证其活性；随后采用let-7a-5p模拟物和抑制剂调控ASMCs细胞内let-7a-5p表达，检测靶基因ITGAV的mRNA表达以及TGFβ1表达和分泌。结果发现let-7a-5p靶向ITGAV基因3′-UTR的靶点从而增加ASMCs细胞外TGFβ1活化。

ASMCs不仅具有收缩功能，其分泌表型也广泛参与气道结构功能的维持及多种气道疾病如气道炎症的发生、发展调控。随着研究的深入，逐渐发现多种细胞内外信号分子参与ASMCs分泌表型的调节。作为一种新的信号调节分子，miRNAs被认为在调节气道炎症和气道重塑中起着关键作用，如miR-216a靶向JAK2调节气道重构[10-11]。虽然miRNA多达上千种，但报道显示miR-23b、miR-24、miR-30b、miR-451和let-7家族在肺中高度表达[12-15]。尤其是，let-7a-5p作为炎症反应和细胞表型的调节因子，可以通过靶向抑制转录因子的活性Smad2和STAT3表现抗炎特性，从而抑制TGF-β2诱导的细胞迁移、侵袭和上皮间充质转化[16]。

miRNA与靶标mRNA的3′或5′非翻译区甚至CDS区进行不完全，不精确的碱基配对，从而抑制mRNA的翻译或降解mRNA[17]。目前，寻找miRNA靶基因的主要方法是通过生物信息学预测,但生物信息学对miRNA靶基因的预测存在较大的假阳性，仍需要通过实验的方法来验证生物信息学预测的是否准确[18]。本研究采用Starbase、miRwalk、miRmap多个数据库预测分析发现整合素家族的多个基因，如ITGAV是let-7a-5p的靶基因。经双荧光素酶报告基因分析、ASMCs转染let-7a-5p后ITGAV表达分析，确认let-7a-5p可以靶向ITGAV的3′-UTR区域，从而降低ITGAV的基因表达。

本研究采用海肾和萤火虫双荧光素酶报告基因，其中萤火虫荧光素酶报告基因的组成型活性提供内对照，反应转染、细胞及质粒等系统的良好状态，而海肾荧光素酶报告基因的活性可以判断整合基因受let-7a-5p调节的活性变化，从而准确判断let-7a-5p与ITGAV相互作用的准确性。本研究的荧光素酶报告实验选择HEK293T作为受试细胞，HEK293T细胞具有易于培养、细胞贴壁能力强和高转染效率的特点，选择该细胞来进行荧光素酶报告基因分析，实验结果的可信度更高，双荧光素酶报告结果验证了let-7a-5p直接调控ITGAV的基因表达。

整合素是粘着斑跨膜结构的重要分子，可以通过粘着斑内其成分如vinculin和talin调节细胞的形态和生物力学行为[19-20]。这些分子可以连接细胞外基质和细胞骨架系统，在许多细胞行为中发挥基本作用，如细胞形态、细胞骨架分布和收缩/舒张、细胞粘附、生长和迁移[21-22]，并且一些整合素亚型如ITGβ3已被证明可被let-7a-5p直接靶向[9]。本研究发现let-7a-5p调控细胞内ITGAV的表达，且通过双荧光素酶实验证明了let-7a-5p通过靶向ITGAV降低细胞内TGFβ1的mRNA表达，但增加细胞外TGFβ1分泌量，提示其可以促进细胞外TGFβ1活化。

TGFβ1是一组多效性细胞因子，具有独特的抗炎和免疫调节特性，且在肺纤维化发病机制中起关键作用，而整合素可能是抗纤维化治疗的新靶点。有报道显示多种miRNAs可以通过靶向整合素调控TGFβ1的表达和活化。本研究发现let-7a-5p可能通过靶向ITGAV促进ASMCs的TGFβ1的活化，从而影响气道炎症的发展。

let-7a-5p的靶向分子众多，包括整合素家族的多个亚型，本研究结果并未确认let-7a-5p仅通过靶向ITGAV调控TGFβ1的表达和活化，其他整合素家族分子可能也参与let-7a-5p对ASMCs的TGFβ1表达和活化，有待于后续进一步研究。

综上所述，本研究成功构建ITGAV基因3′-UTR荧光素酶报告载体，证明let-7a-5p可以通过靶向ITGAV 3′-UTR降低ASMCs细胞内ITGAV和TGFβ1的表达，但增加细胞外分泌TGFβ1量，提示let-7a-5p可能通过靶向ASMCs ITGAV从而促进细胞外TGFβ1活化。研究结果为进一步发掘let-7a-5p作为ASMCs的分泌调控分子和相关药物开发提供实验基础。