用于核酸检测的现场即时检测装置设计*

谢璐，吴义才，刘家宇，陈留晓，谈鸿伟，汪圣舟，韦依珊，邹任玲,2△，李丹，胡秀枋

(1.上海理工大学健康科学与工程学院，上海 200093;2.上海贝瑞电子科技有限公司，上海 201100)

引言

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是体外诊断领域的一项关键技术，该技术的基本原理[1-2]是利用特异性核酸引物和具有链置换效应以及识别延伸效应的Bst DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)，在6～65℃恒温条件下，经过30～60 min，即可将样本中包含目标片段基因的少量核酸分子扩增至千百万份，进而实现从样本中检测出特定病原体的核酸分子的目的。

相比较体外诊断领域中的其他检测技术，LAMP技术具有高灵敏度、运行简便、实验装置低廉、高特异性等优势[3]，更能满足快速准确检测病原微生物的需求，被广泛应用于多种疾病的确诊，包括新型冠状病毒[4-5]、HPV病毒[6]、诺如病毒[7]、流感病毒[8]等，在病原微生物现场[9-10]、基层检测[11]等即时检测领域，该技术也获得了越来越多的关注。

分子POCT(point of care testing)技术[12-13]，也被翻译为“现场即时检测技术”，是基于核酸检测技术上发展起来的一个理念。该理念保留了核酸检测流程中最为核心的内容“采样—分析—输出”，以满足在最短的时间内得到准确检验结果的临床要求。而环介导等温扩增的技术特点可以很好地适配该技术理念。因此，本研究以LAMP技术为基础，结合分子POCT的理念，设计了一款用于核酸检测的POCT装置。

在LAMP技术的实验装置中，包含核酸扩增和定量检测两个核心模块。核酸扩增模块的主要功能是提供60～65℃的恒温条件。在传统的核酸扩增系统中，通常使用帕尔贴元件或电阻丝作为热源，通过热传导对目标物实现加热[14]。帕尔贴的优势在于它集升降温功能于一身，控制简单；缺点在于价格较高，且难以定制。电阻丝相对而言价格低、适应范围广。因此，本研究采用内含电阻丝的陶瓷加热片作为热源对温度控制。

定量检测模块的主要任务是对扩增中的核酸分子进行检测，目前检测 LAMP 产物的主要方法有凝胶电泳法，嵌合染料法，浊度法，金属离子指示剂法[15]和荧光探针法[16]等。不同的检测方法决定了LAMP技术的检测能力和精度，相比较其他检测方法，荧光探针法具有分辨率高、检测准确的优点。因此，本研究依据荧光探针法设计定量检测模块。

传统的荧光探针检测装置的光路结构为光纤光路[17-20]和共聚焦光路[21-22]，这两类光路结构使用滤光片将荧光从发射光中分离，并采用透镜系统将其传递到传感器中。而滤光片和透镜的成本较高，且装配要求高，是核酸扩增与检测装置中最为昂贵的模块。因此，采用新的光路结构设计降低成本十分有意义。

本研究依照聚合酶链式反应医药的行业标准[23]要求，对装置的核酸扩增能力和荧光检测能力进行设计，并进行相关的实验验证。

1 材料与方法

系统设计包括核酸扩增模块与核酸检测模块两个关键部分。核酸扩增模块采用陶瓷加热片与散热风扇相结合的方式，创造一个65℃的恒温环境，以实现样本内部核酸分子的扩增；核酸定量检测模块由光路系统、光电检测电路与上位机数据处理软件三部分组成，其对核酸扩增过程中产生的荧光进行实时检测与记录，帮助实验人员对检测结果进行分析。

1.1 核酸扩增模块设计

在本装置中，核酸扩增模块由6061-T6铝合金、陶瓷加热片与散热风扇三部分组成。其中6061-T6铝合金加工性能好、导热性佳，将其作为核酸扩增模块中的导热介质，通过控制其温度来实现实验过程中的恒温效果。

将铝合金加工为上下两个部分，见图1。下部分铝合金作为底座承载样本管，侧面与陶瓷加热片和散热风扇连接，采用单片机控制陶瓷加热片和散热风扇的开关，用于维持底座温度恒定，实现恒温核酸检测试剂所需的稳定温度环境；上部分铝合金作为热盖通过与底座之间的热传导实现温度控制，目的是确保样本管上下部位温度一致，避免在实验过程中产生大量冷凝水，影响核酸扩增与荧光信号的采集。

图1 恒温温控模块结构示意图Fig.1 Schematic diagram of the thermostat temperature control module

1.2 核酸检测模块设计

荧光探针法[24]通过使用带有6-羧基荧光素(FAM)荧光标记的Taqman探针，该荧光基团能够在约490 nm波段的激发光源的激励下产生520 nm波段的荧光。核酸扩增过程中，探针完整性被破坏，荧光基团脱落，在受到入射光激发后，产生微弱的荧光。

荧光强度随着核酸分子浓度变化，实现核酸浓度定性与定量检测的功能。荧光强度的检测反映了扩增后核酸分子的浓度，因此，荧光检测的光路设计直接影响了核酸分子的检测精度。

1.2.1检测光路设计 在核酸检测装置中，传统的荧光检测光路结构主要有光纤型光路和共聚焦型光路，其光路结构见图2。

图2 传统荧光检测光路结构原理图Fig.2 Schematic diagram of traditional fluorescence detection optical path structure

光纤型光路的核心是采用光纤将光源发出的光传导至样本中，并利用另外一根光纤将荧光传导至光电传感器。通常光纤长度较大，光功率会出现明显的损耗，因此，需要透镜对光进行聚焦处理，以保证检测效果，该光路结构的优点是应用场景较为灵活。文献[17-20]和上海宏石SLAN-96P荧光定量PCR仪均采用该光路结构。

共聚焦型光路的核心是利用二向色分光镜对入射光和荧光信号进行分离处理，多用在只能从样本上方采集荧光信号的设备中。文献[21-22]和赛默飞ABI7500荧光定量PCR仪等产品采用该光路结构。

这两种光路结构中均需要采用入射滤光片和检测滤光片两个带通滤光片对光信号进行处理。其中,入射滤光片的功能是将光源的发射波长限制在荧光基团所能吸收的范围内。检测滤光片的波长范围是基团所发射荧光的波长范围。

由于入射光与荧光的光功率相差极大，若入射滤光片与检测滤光片的波长范围存在交叉，则荧光信号将会被入射光淹没，导致不能被光电传感器检测到。

为了保证检测光路能够实现其检测功能，入射光滤光片与检测滤光片是传统荧光检测光路结构中的必要元器件。但滤光片的存在会增加光路结构的成本，且滤光片属于精密光学元器件，其安装要求较高，不利于该技术向基层推广。

针对以上问题，本研究依据PCR荧光检测原理，采用正交型光路对传统荧光检测光路结构进行优化。具体机理如下：

位于试管正下方的LED光源发射出的入射光经过遮光板B内部的光纤约束后，以较小直径的光斑照射到试管内的样本中。由于LED光源位于试管的正下方，因此，入射光全部向上照射，并最终被吸光板所吸收，且不会被试管侧面的光电传感器检测到。

随着实验的进行，样本内的核酸分子开始扩增，浓度提高，对应的荧光物质的浓度也不断提高[25]，荧光将被入射光激发出来。并以漫反射的形式出现。部分被激发出的荧光会向试管侧面照射，经过遮光板A内部的光纤约束后，进入到试管侧面的光电传感器中。光电传感器在受到荧光照射后产生对应的电信号，并通过光电检测电路实现对该电信号的放大滤波和模数转换。其光路结构原理见图3。

图3 正交光路结构原理图Fig.3 Schematic diagram of orthogonal optical path structure

本研究中的光路结构可以在不使用滤光片和透镜的情况下，减少入射光对荧光采集的影响，降低核酸检测装置中的光学检测部分的成本与技术难度。同时，光路结构设计紧凑，使各元器件之间不存在相对位移，保证了光路结构的稳定性，并且该光路扩展性强，可以选用多色LED配合多种荧光探针实现单样本管内多种核酸靶标的检测。由于本研究只验证该光路结构的可行性，因此，只采用单色LED进行试验验证。

1.2.2光电检测电路设计 POCT装置的电路系统框架见图4。光电检测模块采集样本被激发出的荧光信号通过MCU进行数据接收，并处理发送至上位机用于显示和保存。同时，MCU控制加热片和散热风扇用于保持实验环境的恒温。

图4 装置电路系统整体框图Fig.4 Overall frame diagram of the device circuit system

目前荧光检测中通常采用的光电传感器共有三类，分别是工业相机[18](CCD),光电倍增管[17,21](PMT)和硅光电二极管[19](PD)。三者的优缺点见表1。

表1 常用光电传感器优缺点Table 1 Advantages and disadvantages of common photoelectric sensors

本研究要实现用于核酸检测的POCT装置设计，因此，不采用功耗大、成本高的PMT和体积较大的CCD，而采用体积小、技术成熟的PD作为光电传感器对荧光信号进行检测。

由于荧光信号的光功率为亚nW量级，极为微弱。PD是通过将光信号(光功率值)转化为电流信号进行工作，在荧光的照射下，其产生的电流也极为微弱，极易受到背景噪声和电路热噪声的影响。因此，在设计放大电路之前必须严格控制PD和运算放大器的参数，选择最适合的型号。

经过多次选型与测试，最终本研究光电检测模块中使用滨松光子型号为S1133-01的硅光电二极管作为光电传感器，使用静电级运算放大器ADA4530进行运算放大，二者的关键参数见表2、表3。

表2 硅光电二极管S1133-01关键参数表Table 2 Key parameters of silicon photodiode S1133-01

表3 运算放大器ADA4530关键参数表Table 3 Key parameters of operational amplifier ADA4530

其中，暗电流表示在无入射光的情况下，PD仍存在的电流输出，该型号PD的暗电流最大为10 pA，不影响微弱荧光的检测。结电容越大，放大电路的噪声越大，因此，尽量选择较小的结电容，该PD的结电容低于1 nF，可以进行低噪声电路设计。较大的结电阻可以保证PD产生的光电流全部流向放大电路，该PD结电阻最小为10 GΩ，可以满足电路需求。

开环直流增益和增益带宽积两个参数直接影响运放的放大能力，在本研究中这两个参数应尽量大；而输入偏置电流、输入失调电流和输入失调电压会产生噪音，使信号的转化产生误差，因此，这三者的值应尽可能的小。

在选定元器件以后，将ADA4530配置为跨阻放大器，与以光伏模式工作的S1133-01相连接，其电路图见图5。

图5 带光电二极管的跨阻放大器电路图Fig.5 Circuit diagram of transresistance amplifier with photodiode

在采样电路中，采用精度为24位的AD7799芯片将模拟信号转化为数字信号；为保证精准性，选择AD680作为电压基准芯片，并且在输入端接入LC滤波，在输出端接入双电容减少纹波，使其提供的电压更加精准(见图6)。

图6 AD模数转换电路图Fig.6 Circuit diagram of Analog-to-Digital conversion

ADA4530通常需要±5 V电源供电，因此，电源模块由DC/DC芯片和LDO芯片构成。DC/DC芯片选用LM2664，将USB接口接入的5 V电压转变为-5 V电压。LDO芯片选用SPX3819，在此电路中它将5 V电压转化为3.3 V电压，用于给微控制器供电(见图7)。

图7 光电检测电路电源部分原理图Fig.7 Schematic diagram of power supply part of photoelectric detection circuit

1.2.3软件设计 基于QT为本装置设计了一款上位机用于对数据进行处理与展示，通过USB接口传输至计算机，根据串口的通讯参数，对通讯协议、采样频率、波特率和数据校验位等进行了设置，以实现数据的采集和导出功能(见图8)。

图8 上位机与数据存储Fig.8 Host computer and data storage

1.3 装置性能测试实验设计

图9为本研究所设计核酸检测POCT装置的实物图。为了验证该装置的温控与荧光检测能力，参考行业标准设计了荧光强度重复性实验、荧光浓度梯度线性实验、环境光强变化实验和温度控制精度实验。

图9 核酸检测POCT装置实物图Fig.9 Picture of POCT device for nucleic acid detection

1.3.1荧光检测能力测试实验 荧光检测能力测试实验采用上海吉至(ACMEC)公司的6-羧基荧光素(FAM)作为荧光染料配置荧光标准品。调制荧光标准品采用的移液枪品牌为大龙生物(DLAB)，其允许最大系统误差为0.006～0.18 uL。

以荧光染料溶于水的饱和液作为母液标定为1，进行梯度稀释，分别为：1/16浓度、1/32浓度、1/64浓度、1/128浓度、1/256浓度、1/512浓度与去离子水。用以上7个液体作为检测样本进行检测。

1.3.2温度控制精度检测实验 温度控制精度检测实验采用FLIRA615红外热像仪实时对加热装置进行温度监测，温度检测灵敏度小于0.05℃。

2 结果与讨论

2.1 荧光检测能力测试实验结果

2.1.1荧光强度重复性实验 光强度检测重复性应保证用高、中、低浓度校准染料重复检测，其变异系数CV不大于3%。

图10为各浓度梯度的10次重复性实验，由图可知，每一浓度的重复性检测结果偏差极小，接近一条直线。

图10 各浓度荧光染剂的荧光强度值Fig.10 The fluorescence intensity of each concentration of fluorescent dye

图11为不同浓度梯度10次检测后的CV值与行业标准CV值的对比，可以看出，本研究求得CV值远低于行业标准规定的CV值。因此，表明本装置光路结构对荧光强度检测具有良好的重复性与稳定性。

图11 检测荧光CV值与规定CV值对照图Fig.11 Comparison diagram of detected fluorescence CV value and specified CV value

其中，CV为变异系数；SD为标准差；M为测量结果平均值。

2.1.2荧光浓度梯度线性实验 荧光浓度梯度线性实验用于验证荧光强度变化与核酸分子浓度变化的相关性，该项指标直接反映了光路结构对核酸分子浓度检测的灵敏度与真实性。

根据行业要求规定，对系列稀释荧光染料的样本(至少5个梯度)进行检测，各浓度荧光测定值与稀释比例的线性相关系数r应不低于0.990。表4为各浓度梯度的荧光强度平均值与标准差，以及计算所得相关系数。由表4可知，检测所得相关系数为0.997，高于行业标准0.990，可知本研究光路结构检测所得荧光信号与DNA浓度变化有着极好的相关性，可真实反应DNA浓度的变化。

表4 荧光染剂浓度与检测荧光光功率相关系数Table 4 Correlation coefficient between fluorescence dye concentration and detection fluorescence light power

其中，Cov(X,Y)为协方差，Var[X]Var[Y]分别为X、Y的方差。

2.1.3环境光强变化实验 通过对比在不同环境下装置对同一样本的检测结果，验证其光密封性与不同环境检测的适应能力。

采用t检验对比光强为92.5～94.3 Lux的自然光环境与光强为0.2～0.9 Lux的暗室中装置的荧光检测能力。图12为暗室环境与自然光环境下，重复测试10次所得平均值。表5为不同环境、不同浓度梯度下，求得t检验结果。本次实验t检验结果P=0.99897，当t检验P>0.05时，无显著差异，所以在不同环境光强下，该装置的检测能力不受影响。

图12 暗室与自然光状态下荧光强度对照图Fig.12 Comparison of fluorescence intensity between darkroom and natural light

表5 暗室与自然光状态下荧光强度t检验结果Fig 5 Fluorescence intensity t test results in dark room and natural light

2.2 温度控制精度实验

为验证本研究装置温度控制的精度，使用红外热像仪对铝块加热的过程进行实时监测，实验参数设置为室温28℃，6061铝合金辐射率为0.95，相对湿度50%。行业标准要求，温度控制精度应不大于±0.5℃。

在10 min内，平均每分钟对6061铝合金块进行采样，其温度浮动范围小于0.5℃，计算其标准差为0.143，满足行业标准要求。实验结果见图13。

图13 红外热像仪温度检测结果Fig.13 Thermal imaging camera temperature test table

3 结论

本研究研制了一种基于环介导等温扩增技术的用于核酸检测的POCT装置，使用时只需将调制好的样本放置入核酸检测装置中，即可进行核酸扩增和检测实验。

依照核酸检测领域相关行业标准，本研究对所设计的装置性能进行测试。结果表明，温度控制精度小于±0.5℃；荧光强度检测结果变异系数小于行业标准所要求的3%；线性实验相关系数为0.997，大于行业标准0.990；不同环境光强变化实验的t检验分布结果证明了在不同环境下，检测结果无显著性差异。证明该装置能够实现核酸扩增与检测的功能，具有可靠性与稳定性。

相比较传统的核酸检测装置，本研究装置体积小、成本低、能耗小、操作简单、适配性强，且满足行业标准所给定的核酸扩增与荧光检测的要求，因此，可以满足多种核酸自提取试剂的检测需求。

本研究装置可以克服传统检测过程需要实验室、大型实验设备与专业操作人员的缺点，实现了“现场即时检测”理念中的分析与输出目标。后续可以推进的工作包括在核酸自提取试剂的基础上设计核酸采样模块 ，荧光检测模块实现多种荧光的同时检测，核酸扩增模块实现不同温度循环控制并进行实际生物样本检测等，以实现单一样本多种病原体的检测功能，适配更多类型的核酸检测试剂。