阿糖胞苷通过调控miR-126表达抑制急性髓系白血病细胞增殖及诱导细胞凋亡的分子机制研究

林晓媛 王波涛 党惠兵 （河南省南阳医学高等专科学校第一附属医院血液内科，南阳 473000）

急性髓系白血病是临床常见的一种急性白血病，近年来，急性髓系白血病发病率逐年上升，而骨髓移植或干细胞移植是主要治疗方法，但移植易引起并发症从而影响患者生活质量［1-3］。临床采用化疗方法治疗急性髓系白血病，但患者易产生化疗耐受性从而降低治疗效果，但调控相关基因表达可逆转化疗药物耐受性［4］。阿糖胞苷可能通过抑制cFLIP 基因表达从而诱导白血病细胞凋亡［5］。微小RNA-126（miR-126）在肿瘤中表达下调，上调其表达可抑制肿瘤细胞增殖及诱导细胞凋亡［6］。但阿糖胞苷是否通过调控miR-126表达从而影响急性髓系白血病细胞增殖及凋亡尚未可知。因此，本研究主要探讨阿糖胞苷对急性髓系白血病细胞增殖及凋亡的影响，探究其对miR-126的调控作用，为进一步阐释阿糖胞苷治疗白血病的分子机制奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料 阿糖胞苷购自美国Sigma 公司；人急性髓系白血病细胞HL-60 购自中科院上海细胞库；杜氏改良培养基（DMEM）、胎牛血清购自美国Gibco公司；Lipofectamine2000 购自北京索莱宝科技有限公司；miR-126 寡核苷酸模拟物（miR-126 mimics）及阴性对照mimic NC 序列（miR-NC）、miR-126 特异性寡核苷酸抑制剂（anti-miR-126）及其阴性对照（antimiR-NC）购自上海吉玛制药技术有限公司；甲基噻唑基四唑（MTT）购自生工生物工程（上海）股份有限公司；细胞凋亡试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司；Trizol 试剂购自北京全式金生物技术有限公司；反转录、荧光定量检测试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；兔抗人增殖标记蛋白细胞增殖核抗原67（Ki67）、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved-caspase-3）抗体购自美国Santa Cruz 公司；兔抗人磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信号通路相关蛋白磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶（p-PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）抗体购自美国CST 公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG 二抗购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 HL-60 细胞培养于含有10%胎牛血清的培养基，常规培养，每2 d更换1次培养液，使用0.25%胰蛋白酶进行传代，待细胞生长至70%融合度时将细胞接种于96 孔板（5×103个/孔），分别加入含有不同浓度（1、3、9µmol/L）的阿糖胞苷处理24 h［7］，分别记作1 µmol/L 阿糖胞苷组、3 µmol/L 阿糖胞苷组、9µmol/L阿糖胞苷组。同时将正常培养的细胞作为NC组。后续实验设置miR-NC组（miR-NC转染至HL-60 细胞）、miR-126 组（miR-126 mimics 转染至HL-60细胞）、anti-miR-NC 组（anti-miR-NC 转染至HL-60细胞）、anti-miR-126组（anti-miR-126转染至HL-60细胞）、阿糖胞苷+anti-miR-NC组（anti-miR-NC转染至HL-60 细胞，加入浓度为3 µmol/L 的阿糖胞苷处理24 h）、阿糖胞苷+anti-miR-126组（anti-miR-126转染至HL-60 细胞，加入浓度为3 µmol/L 的阿糖胞苷处理24 h）。

1.2.2 MTT 检测细胞增殖 取对数生长期HL-60细胞，0.25%胰蛋白酶消化，加入培养基制备细胞悬液，调整细胞密度为2.5×104个/ml，接种于96 孔板（100µl/孔），按照1.2.1 分组处理，分别向各孔加入20µl MTT 溶液，室温培养4 h，弃上清，分别加入150 µl 二甲基亚砜（DMSO），室温振荡孵育10 min，应用酶标仪检测各孔吸光度值（OD 值），计算细胞增殖率（%）=实验组OD值/空白组OD值×100%。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡率 收集各组HL-60 细胞，预冷PBS 清洗，4 ℃下3 000 r/min 离心6 min，弃上清，向细胞沉淀中加入500 µl Binding Buffer 悬浮细胞，参照细胞凋亡试剂盒分别加入5µl Annexin V-FITC 与5µl PI，充分混匀，室温避光孵育10 min，应用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

1.2.4 实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测miR-126 的表达水平 收集各组HL-60 细胞，采用Trizol 法提取细胞总RNA，应用紫外分光光度计测定RNA 浓度。反转录体系：5×g DNA Buffer 2µl，10×King RT Buffer 2µl，FastKing RT Enzyme Mix 1µl，FQ-RT Primer Mix 2 µl，RNA（2 µg），RNase-Free ddH2O 补足体系至20 µl；反应条件：42 ℃15 min，95 ℃3 min。反转录得到cDNA，以cDNA 为模板进行qRT-PCR 反应，反应体系与反应条件均参照荧光定量试剂盒进行操作。其中miR-126 正向引物5'-TACTTTTGGTACGCGCTGTG-3'，反 向 引 物5'-GC⁃TAGCTACGATCACACTACG-3'；U6 正 向 引 物5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，反向引物5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。miR-126 以U6 为内参，采用2-ΔΔCt法计算miR-126相对表达量。

1.2.5 Western blot 检测Ki67、Cleaved-caspase-3、p-PI3K、p-AKT 蛋白表达 收集各组HL-60 细胞，加入蛋白裂解液提取细胞总蛋白。BCA 法检测蛋白浓度，蛋白变性，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白，将分离的蛋白凝胶转移至PVDF 膜，室温封闭2 h，加入一抗稀释液（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，TBST洗涤，加入二抗稀释液（1∶2 000），室温孵育1 h，TBST 洗涤，曝光，显影，应用Image J软件分析各条带灰度值。

1.3 统计学处理 采用SPSS21.0统计学软件分析数据，计量资料以±s表示且均符合正态分布，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度阿糖胞苷对急性髓系白血病细胞HL-60 增殖的影响 与NC 组比较，1µmol/L 阿糖胞苷组、3µmol/L 阿糖胞苷组、9µmol/L 阿糖胞苷组细胞增殖率显著降低（P＜0.05），Ki67 蛋白水平显著降低（P＜0.05），见图1、表1。

表1 不同浓度阿糖胞苷对急性髓系白血病细胞HL-60增殖的影响（±s，n=9）Tab.1 Effects of different concentrations of cytarabine on proliferation of acute myeloid leukemia cells HL-60（±s，n=9）

表1 不同浓度阿糖胞苷对急性髓系白血病细胞HL-60增殖的影响（±s，n=9）Tab.1 Effects of different concentrations of cytarabine on proliferation of acute myeloid leukemia cells HL-60（±s，n=9）

Note：Compared with NC group，1）P＜0.05.

Rate of cell proliferation/%100.25±9.68 88.66±7.251）51.32±4.011）42.38±3.111）165.567 0.000 Groups NC 1µmol/L cytarabine 3µmol/L cytarabine 9µmol/L cytarabine FP Ki67 0.85±0.07 0.72±0.061）0.37±0.021）0.31±0.031）255.031 0.000

图1 Western blot检测Ki67蛋白的表达Fig.1 Western blot was used to detect expression of Ki67 protein

2.2 阿糖胞苷对急性髓系白血病细胞HL-60 凋亡的影响 与NC 组比较，1 µmol/L 阿糖胞苷组、3 µmol/L 阿糖胞苷组、9 µmol/L 阿糖胞苷组细胞凋亡率显著升高（P＜0.05），Cleaved-caspase-3 蛋白水平显著升高（P＜0.05），见图2、表2。

表2 阿糖胞苷对急性髓系白血病细胞HL-60 凋亡的影响（±s，n=9）Tab.2 Effects of cytarabine on apoptosis of acute myeloid leukemia cells HL-60（±s，n=9）

表2 阿糖胞苷对急性髓系白血病细胞HL-60 凋亡的影响（±s，n=9）Tab.2 Effects of cytarabine on apoptosis of acute myeloid leukemia cells HL-60（±s，n=9）

Note：Compared with NC group，1）P＜0.05.

Apoptotic rate/%5.69±0.43 12.53±0.951）21.34±1.521）25.46±1.281）562.529 0.000 Groups NC 1µmol/L cytarabine 3µmol/L cytarabine 9µmol/L cytarabine FP Cleaved-caspase-3 0.33±0.03 0.46±0.041）0.75±0.071）0.88±0.081）154.326 0.000

图2 阿糖胞苷对急性髓系白血病细胞HL-60凋亡的影响Fig.2 Effects of cytarabine on apoptosis of acute myeloid leukemia cells HL-60

2.3 阿糖胞苷对miR-126表达的影响 与NC 组比较，阿糖胞苷组miR-126 的表达水平显著升高（1.00±0.08vs5.86±0.34，t=41.742，P＜0.05）。

2.4 miR-126 对急性髓系白血病细胞HL-60 增殖和凋亡的影响 与miR-NC 组比较，miR-126 组细胞增殖率显著降低（P＜0.05），细胞凋亡率显著升高（P＜0.05），Ki67 蛋 白 水 平 显 著 降 低（P＜0.05），Cleaved-caspase-3 蛋白水平显著升高（P＜0.05）；与anti-miR-NC 组比较，anti-miR-126 组细胞增殖率显著升高（P＜0.05），细胞凋亡率显著降低（P＜0.05），Ki67蛋白水平显著升高（P＜0.05），Cleaved-caspase-3蛋白水平显著降低（P＜0.05），见图3、表3。

表3 miR-126对急性髓系白血病细胞HL-60增殖和凋亡的影响（±s，n=9）Tab.3 Effects of miR-126 on proliferation and apoptosis of acute myeloid leukemia cells HL-60（±s，n=9）

表3 miR-126对急性髓系白血病细胞HL-60增殖和凋亡的影响（±s，n=9）Tab.3 Effects of miR-126 on proliferation and apoptosis of acute myeloid leukemia cells HL-60（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P＜0.05；compared with antimiR-NC group，2）P＜0.05.

Apoptotic rate/%5.53±0.38 16.34±1.261）5.67±0.33 3.01±0.112）682.957 0.000 Groups Ki67 miR-NC miR-126 anti-miR-NC anti-miR-126 FP 0.85±0.07 0.46±0.031）0.82±0.08 1.05±0.092）106.936 0.000 Cleavedcaspase-3 0.35±0.03 0.76±0.061）0.33±0.02 0.11±0.012）529.140 0.000 Rate of cell proliferation/%100.33±9.24 44.27±3.241）101.57±9.83 136.12±10.292）174.323 0.000

图3 Western blot检测Ki67、Cleaved-caspase-3蛋白的表达Fig.3 Western blot was used to detect expressions of Ki67 and Cleaved-caspase-3 protein

2.5 anti-miR-126 可以逆转阿糖胞苷对急性髓系白血病细胞HL-60增殖、凋亡的影响 与阿糖胞苷+anti-miR-NC 组比较，阿糖胞苷+anti-miR-126 组细胞增殖率显著升高（P＜0.05），细胞凋亡率显著降低（P＜0.05），Ki67 蛋 白 水 平 显 著 升 高（P＜0.05），Cleaved-caspase-3 蛋白水平显著降低（P＜0.05），见图4、表4。

表4 Anti-miR-126可以逆转阿糖胞苷对急性髓系白血病细胞HL-60增殖、凋亡的影响（±s，n=9）Tab.4 Anti-miR-126 could reverse effect of cytarabine on proliferation and apoptosis of acute myeloid leukemia cells HL-60（±s，n=9）

表4 Anti-miR-126可以逆转阿糖胞苷对急性髓系白血病细胞HL-60增殖、凋亡的影响（±s，n=9）Tab.4 Anti-miR-126 could reverse effect of cytarabine on proliferation and apoptosis of acute myeloid leukemia cells HL-60（±s，n=9）

Note：Compared with cytarabine+anti-miR-NC group，1）P＜0.05.

Apoptotic rate/%20.88±1.37 10.26±0.821）19.954 0.000 Groups Cytarabine+anti-miR-NC Cytarabine+anti-miR-126 tP miR-126 1.00±0.11 0.46±0.041）13.841 0.000 Ki67 0.40±0.03 0.72±0.061）14.311 0.000 Cleaved-caspase-3 0.77±0.07 0.35±0.031）16.545 0.000 Rate of cell proliferation/%51.38±4.03 85.26±7.161）12.371 0.000

图4 Western blot检测Ki67、Cleaved-caspase-3蛋白的表达Fig.4 Western blot was used to detect expression of Ki67 and Cleaved-caspase-3 protein

2.6 PI3K/AKT 信号通路相关蛋白的表达 与NC组比较，阿糖胞苷组p-PI3K、p-AKT蛋白水平显著降低（P＜0.05）；与阿糖胞苷+anti-miR-NC组比较，阿糖胞苷+anti-miR-126 组p-PI3K、p-AKT 蛋白水平显著升高（P＜0.05），见图5、表5。

图5 Western blot检测p-PI3K、p-AKT蛋白的表达Fig.5 Western blot was used to detect expressions of p-PI3K and p-AKT protein

表5 PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达（±s，n=9）Tab.5 PI3K/AKT signaling pathway related protein expression（±s，n=9）

表5 PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达（±s，n=9）Tab.5 PI3K/AKT signaling pathway related protein expression（±s，n=9）

Note：Compared with NC group，1）P＜0.05；compared with cytarabine+anti-miR-NC group，2）P＜0.05.

p-AKT 0.62±0.06 0.32±0.031）0.34±0.04 0.52±0.052）87.628 0.000 Groups NC Cytarabine Cytarabine+anti-miR-NC Cytarabine+anti-miR-126 FP p-PI3K 0.72±0.07 0.41±0.031）0.38±0.04 0.65±0.062）94.909 0.000

3 讨论

急性髓系白血病属于常见的恶性肿瘤之一，目前临床采用氟达拉滨、地西他滨、高三尖杉酯碱等药物剂型治疗，可有效杀死白血病细胞，但存在较大的副作用，还可导致部分患者产生耐药性［8-10］。因而积极探究化疗药物治疗白血病的分子机制，试图寻找其作用靶点，进而逆转部分化疗药物的耐药性，最终提高治疗效果及增强化疗药物的敏感性。

阿糖胞苷属于嘧啶类抗代谢药物，其可杀伤肿瘤细胞，还可与顺铂联用从而抑制鼻咽癌细胞生长及诱导细胞凋亡［11-12］。阿糖胞苷可抑制急性髓系白血病细胞生长，其作用机制可能与调控PRDX 表达有关［13］。本研究结果显示阿糖胞苷可显著抑制急性髓系白血病细胞增殖，并可抑制Ki67 表达，研究表明Ki67 表达上调可能促进细胞周期进展进而促进细胞增殖［14］。本研究结果显示阿糖胞苷可能通过调控细胞增殖相关蛋白表达从而抑制急性髓系白血病细胞增殖。本研究进一步分析显示阿糖胞苷可显著增高急性髓系白血病细胞凋亡率，并可促进Cleaved-caspase-3 表达，已有报道指出caspase 介导的细胞凋亡途径在肿瘤发生及发展过程中发挥重要调控作用，线粒体损伤时可促进细胞色素C 释放至细胞质从而激活caspase 级联反应，caspase 被激活后可形成Cleaved-caspase-3 等从而诱导细胞凋亡［15］。提示阿糖胞苷可能通过线粒体途径从而诱导急性髓系白血病细胞凋亡。

miR-126 卵巢癌中表达下调，LncRNA LNC01133 通过充当miR-126 的海绵分子而促进卵巢癌的发生［16］。miR-126 通过靶向ADAM9 抑制口腔鳞状细胞癌细胞迁移及侵袭［17］。LncRNA-XIST通过充当miR-126的海绵分子从而促进神经胶质瘤细胞增殖［18］。本研究结果显示miR-126过表达后细胞增殖率显著降低，细胞凋亡率显著升高，Ki67 表达下调，Cleaved-caspase-3 表达上调，而抑制miR-126 表达后细胞增殖率显著升高，细胞凋亡率显著降低，Ki67 表达上调，Cleaved-caspase-3 表达下调，提示miR-126在急性髓系白血病发生及发展过程中可能发挥抑癌基因作用。同时本研究结果显示阿糖胞苷处理后急性髓系白血病细胞中miR-126的表达水平显著升高，由此推测阿糖胞苷可能通过促进miR-126 表达从而抑制急性髓系白血病细胞增殖及诱导细胞凋亡。为验证上述推测，本研究将抑制miR-126 表达并使用阿糖胞苷处理，结果显示细胞增殖率显著升高，细胞凋亡率显著降低，Ki67 蛋白水平显著升高，Cleaved-caspase-3 蛋白水平显著降低，提示阿糖胞苷可通过上调miR-126 表达从而抑制急性髓系白血病细胞增殖及诱导细胞凋亡。研究表明PI3K/AKT 信号通路被激活后可促进前列腺癌、肝细胞癌等肿瘤细胞增殖及转移［19-20］。本研究结果显示阿糖胞苷可显著降低p-PI3K、p-AKT 的表达，而干扰miR-126 表达后可显著促进p-PI3K、p-AKT 表达，提示阿糖胞苷可能通过调控miR-126表达及抑制PI3K/AKT 信号通路的激活从而抑制急性髓系白血病细胞增殖及诱导细胞凋亡。

综上所述，阿糖胞苷可能通过上调miR-126 表达从而抑制急性髓系白血病细胞增殖及促进细胞凋亡，其作用机制可能与抑制PI3K/AKT 信号通路的激活有关，可为白血病的治疗提供潜在靶点。但关于其具体作用机制尚需进一步研究。