人参皂苷G-Rh2通过调节脂质代谢与免疫改善小鼠代谢综合征①

黄容容 张子君 解梦园 苟 静 李 晴 马 坤 向 明

（华中科技大学同济医学院药学院生物药学系，武汉 430030）

代谢综合征（metabolic syndrome，MS）是多种代谢紊乱症候群在同一个体聚集的慢性疾病，表现为高血糖、高血压、血脂异常、腹部肥胖等，易诱发糖尿病、脂肪肝病以及心血管疾病［1-2］。近年来MS 患者大量增加，亟需开发治疗MS 的药物［3］。MS 发病机制是代谢紊乱和慢性炎症相互影响：肝脏和脂肪组织代谢异常易出现胰岛素抵抗，导致肥胖、高血脂［4］；肥胖环境下脂肪扩张引发Th1 细胞、M1 型巨噬细胞以及IL-6、TNF-α 等过度产生，形成慢性炎症，促进脂肪分解，引起血浆脂肪酸升高［5-6］。据报道人参皂苷G-Rh2具有抗糖尿病、肥胖、炎症等药理活性，本课题组前期研究也发现G-Rh2 对肝脏脂肪酸代谢和免疫有调节作用［7-9］。本文旨在探究G-Rh2对MS的治疗作用，并通过代谢和免疫调节途径探究其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 6周龄雄性C57BL/6J小鼠40只，SPF 级，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，合格证号：42000600036134。饲养于华中科技大学实验动物中心（温度25 ℃，相对湿度60%），许可证号SYXK（鄂）2016-0057，适应性喂养1 周后进行实验。本研究经过华中科技大学实验动物伦理委员会批准。

1.1.2 试剂 高脂饲料（北京华阜康生物科技股份有限公司，批号：D12492）；人参皂苷G-Rh2（商品名：今幸胶囊，浙江亚克药业有限公司，每100 g 含16.2 g 人参皂苷G-Rh2，批号：190801）；二甲双胍盐酸盐、洛伐他汀（上海TCI 化成工业发展有限公司，批号POW6L-QH、55FIB-JP）；总胆固醇（total choles⁃terol，TC）、总三酰甘油（total triglycerides，TG）、游离脂肪酸（nonestesterified fatty acid，NEFA）、高密度脂蛋白胆固醇（high density liptein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（low density liptein cholesterol，LDL-C）、谷 丙 转 氨 酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）（南京建成生物工程研究所，批号：A111-1、A110-1、A112-1、A113-1、A042-2、C009-2、C010-2）；BCA蛋白测定试剂盒（Beyotime 公司，批号：P0010S）；PE-Cy5标记的小鼠CD3 流式抗体（美国BD 公司，批号：7069621）；PE标记的小鼠CD8流式抗体（美国BD公司，批号：7132789）；FITC 标记的小鼠CD4 流式抗体（天津三箭生物科技有限公司，批号：AD605）；PE 标记的小鼠NK1.1 流式抗体（上海Biolegend 公司，批号：B190158）；PE 标记的小鼠CD25 抗体（美国BD公司，批号：E021463）；PE-Cy5 标记的小鼠Foxp3 抗体（美国BD 公司，批号：8025968）；PE 标记抗小鼠Gr-1 流式抗体（美国BD 公司，批号：4277720）；APC标记的小鼠CD11b 流式抗体（美国BD 公司，批号：2010622）。

1.1.3 仪器 血糖仪（湖南三诺生物传感股份有限公司）；多功能酶标仪（美国BioTek公司）；C6型流式细胞仪（美国BD 公司）；液相色谱串联质谱仪（LC-MS/MS，美国AB SCIEX 公司）；球磨匀浆机、超声仪、真空干燥机（武汉迈特维尔生物科技有限公司）；HE 染色、油红O 染色分析仪（湖北百奥斯生物科技有限公司）；高速冷冻离心机（上海力新仪器有限公司）；恒温振荡器（太仓豪城实验仪器制造有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物造模、分组及给药 随机挑取8只正常小鼠，给予标准饲料喂养，作为正常对照组（Con）；其余32 只小鼠作为模型组，给予高脂饲料（high-fat diet，HFD，含60%脂肪、20%蛋白质、20%碳水化合物）喂养。喂养期间，每周称量一次小鼠体质量并记录其状态。喂养12 周后，小鼠禁食6 h（自由饮水），尾尖微创采血测定空腹血糖（fasting blood glu⁃cose，FBG）值，眼眶静脉丛取全血200µl，分离血清检测TC、TG、HDL-C、LDL-C 水平。取同时符合下列标准的小鼠作为MS 模型：①体质量高于同期饲养的正常组小鼠平均值；②FBG≥7.0 mmol/L；③血脂TG≥1.55 mmol/L、TC≥2.22 mmol/L、LDL-C≥0.35 mmol/L、HDL-C≤1.20 mmol/L 或与正常组相比有显著性差异［10-12］。

根据造模标准取造模成功的小鼠20只，随机分为4组（每组5只）：模型组（Mod），二甲双胍组（阳性对照，Met，250 mg/kg），洛伐他汀组（阳性对照，Lova，10 mg/kg），G-Rh2 组（10 mg/kg 该剂量依据本课题组前期研究［9］和参考文献［13］确定）。正常对照组和模型组按0.2 ml/只灌胃蒸馏水，各给药组按相应剂量灌胃药物混悬液（蒸馏水配制），1 次/d，连续4 周。给药期间每周称量1 次体质量，末次给药后处死小鼠，剥取小鼠皮下和腹部脂肪，称重并计算脂肪指数。

1.2.2 胰岛素耐量实验（insulin tolerance test，ITT） 给药2 周后，小鼠禁食6 h（自由饮水），皮下注射胰岛素溶液（0.4 U/kg），分别于胰岛素注射后0 min、20 min、40 min 和90 min 采血测定FBG 值，记录所得数据并计算曲线下面积（AUC）。

1.2.3 口服葡萄糖耐量实验（oral glucose tolerance test，OGTT） 给药2周后，小鼠禁食6 h（自由饮水），灌胃葡萄糖溶液（2 g/kg），分别于葡萄糖负荷后0 min、30 min、60 min、90 min、120 min采血测定FBG值，记录所得数据并计算AUC。

1.2.4 胰岛素抵抗指数（homeostasis model assess⁃ment，HOMA-IR）评估 末次给药后，眼眶取血，4 ℃放置3～4 h，高速冷冻离心（6 000 r/min，4 ℃，10 min）收集血清。采用胰岛素试剂盒检测血清中胰岛素含量，通过稳态模型评估HOMA-IR，具体计算公式：HOMA-IR=空腹血糖×空腹胰岛素/22.5。

1.2.5 生化检测 取血清，采用生化试剂盒检测TC、TG、NEFA、HDL-C、LDL-C 水平。取肝脏匀浆，采用生化试剂盒检测肝脏组织中ALT、AST 含量，并用蛋白试剂盒进行均一化。

1.2.6 ELISA 检测炎症因子 取血清，采用ELISA试剂盒检测炎症因子TNF-α、IL-6水平。

1.2.7 肝脏组织病理学分析 末次给药后，脱臼处死小鼠，取肝脏组织同一部位的样本固定于4%的多聚甲醛中，行HE 染色。另取一份肝脏组织迅速冻于液氮中，行油红O染色。

1.2.8 非靶向脂质代谢组学分析 取小鼠肝脏组织同一部位的样本装在预冷的离心管中，迅速转移到-80 ℃冰箱冻存，采用非靶向脂质代谢组学技术检测八大类脂质代谢物含量，并对脂质代谢组学数据进行解析。

1.2.9 流式细胞仪（FACS）检测免疫细胞 末次给药后，脱臼处死小鼠，取出新鲜的脾脏和胸腺组织，置于PBS中保持湿润，碾磨消化后制备单细胞悬液，分装于EP 管中（每管约2×106个细胞），分别加入不同的流式抗体：T 细胞加入PE-Cy5 标记的小鼠CD3抗体、FITC 标记的小鼠CD4 抗体或PE 标记的小鼠CD8 抗体；调节性T 细胞（Treg）加入FITC 标记的小鼠CD4 抗体、PE 标记的小鼠CD25 抗体和PE-Cy5 标记的小鼠Foxp3 抗体；NK 细胞加入PE-Cy5 标记的小鼠CD3 抗体、PE 标记的小鼠NK1.1 流式抗体；骨髓来源的抑制性细胞（bone marrow-derived suppressor cells，MDSCs）加入APC 标记的小鼠CD11b 抗体、PE标记抗小鼠Gr-1 流式抗体；4 ℃避光孵育50 min，加入1 ml PBS，1 200 r/min 离心5 min，重复1 次，用300µl PBS重悬，流式细胞仪检测细胞百分比。

2 结果

2.1 G-Rh2 对MS 小鼠肥胖体征的影响 喂养12 周后，与正常组比较，HFD 饲养小鼠体质量快速增加且明显高于正常组（P＜0.01），呈现出肥胖体型。给药4 周后，与模型组比较，G-Rh2 组小鼠体质量明显下降（P＜0.01），恢复至正常组水平，呈瘦型（图1A、C）。与正常组比较，模型组小鼠脂肪指数显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，G-Rh2 组、二甲双胍组和洛伐他汀组小鼠脂肪指数均明显降低（P＜0.05或0.01，图1B）。

图1 G-Rh2对MS小鼠肥胖体征的影响（n=5）Fig.1 Effects of G-Rh2 on obesity symptom in MS mice（n=5）

2.2 G-Rh2对MS小鼠胰岛素敏感性的影响 给药2 周后，ITT 结果显示：与正常组比较，模型组小鼠AUC增大（P＜0.05）；与模型组比较，G-Rh2组注射胰岛素后FBG 值下降，AUC 减小（图2A）。OGTT 结果显示：与正常组比较，模型组小鼠口服葡萄糖30 min后FBG 值迅速上升，至120 min 时才恢复到初始水平，同时AUC 显著增大（P＜0.01）；与模型组比较，G-Rh2 组小鼠葡萄糖负荷后FBG 值变化幅度小，90 min 时恢复至初始水平，且AUC 明显减小（P＜0.05，图2B）。给药4 周，与正常组比较，模型组小鼠HOMA-IR 显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，G-Rh2 组小鼠HOMA-IR 指数有一定程度的降低（图2C）。

图2 G-Rh2对MS小鼠胰岛素敏感性的影响（n=5）Fig.2 Effects of G-Rh2 on insulin sensitivity in MS mice（n=5）

2.3 G-Rh2 对MS 小鼠血脂的影响 给药4 周，与正常组比较，模型组小鼠血清中4 种脂质TC、TG、NEFA、LDL-C 水平均升高；与模型组比较，G-Rh2 组小鼠血清中NEFA 和LDL-C 水平明显降低（P＜0.01或0.05），TC 水平也下降（P=0.105）；洛伐他汀组TC 和NEFA 水平明显降低（P＜0.01）；二甲双胍组NEFA 水平下降，其余4 种脂质水平无显著变化（图3）。

图3 G-Rh2对MS小鼠血脂的影响（n=5）Fig.3 Effects of G-Rh2 on serum lipid levels in MS mice（n=5）

2.4 G-Rh2对MS小鼠肝脏脂质代谢的影响 给药4周后，与正常组比较，模型组有28种脂质代谢物水平明显下调，222 种脂质代谢物水平明显上调；G-Rh2 组74 种脂质代谢物水平明显下调，8 种脂质代谢物水平明显上调（图4A）。差异倍数柱状图展示：与正常组比较，模型组小鼠肝脏中上调最显著的10种脂质代谢物包括6种三酰甘油（TGs）、2种神经酰胺（Cer）、1 种磷脂酰胆碱（PC）和1 种二酰甘油（DG）；与模型组比较，G-Rh2 组小鼠肝脏中下调最显著的脂质代谢物有12 种，包括4 种TGs、2 种DGs、1 种Cer、2 种PCs、1 种磷脂酰乙醇胺（PE）、1 种溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）和1 种溶血磷脂酰胆碱（LPC）；上调最显著的代谢物有8 种，分别是1 种羟基花生四烯酸（HETE）、2种环氧十八碳烯酸（EpOME）、1种PC、1 种棕榈酸肉碱（palmitoleoylcarnitine）、1 种环氧二十碳三烯甘油酸（EET）、1 种血栓素B2（TXB2）、1种油酰基肉碱（oleyl-carnitine）（图4B）。

聚类分析结果显示，模型组与G-Rh2 组之间共有90 种脂质代谢物参与了聚类，其中G-Rh2 组较模型组减少的脂质代谢物有82 种，大多数是TGs 和磷脂酰胆碱类（PCs），与差异倍数柱状图结果一致。G-Rh2 组较模型组增多的脂质代谢物有8 种，分别是3种LPCs、3种胆固醇脂和2种LPEs（图4C）。

图4 G-Rh2对MS小鼠脂质代谢物的影响（n=5）Fig.4 Effects of G-Rh2 on lipid metabolites in MS mice（n=5）

2.5 G-Rh2 对MS 小鼠脂肪性肝炎的影响 给药4 周后，HE 切片结果显示：正常组小鼠肝脏形态结构完整，中央静脉血管清晰，肝小叶规则，肝索排列整齐；模型组小鼠肝窦萎缩变形，肝窦周围细胞散乱，存在多处炎症细胞聚集区域（黑色箭头所指）；G-Rh2 组小鼠肝脏形态恢复正常，肝小叶呈规则的多面棱柱状，仅中央静脉管周围存在少许炎症细胞，其他肝实质区的炎症细胞较模型组明显减少（图5A）。油红O 染色结果显示：正常组小鼠肝脏油红O 染色呈阴性，蓝色的细胞核清晰，无红色；模型组小鼠肝脏油红O染色呈阳性，有较多红色的脂肪，蓝色的细胞核少，排列疏松并出现大量裂隙；G-Rh2组小鼠肝脏油红O 染色基本呈阴性，细胞核清晰，细胞内脂滴聚集少，红色染色比模型组明显减轻（图5B）。

给药4周后，与正常组比较，模型组小鼠肝脏指数增大，ALT、AST 含量显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，G-Rh2 组小鼠肝脏指数和ALT、AST 含量明显降低（P＜0.05或0.01，图5C、D）。与正常组比较，模型组血清中TNF-α、IL-6 含量升高；与模型组比较，G-Rh2 组TNF-α、IL-6 含量明显降低（P＜0.05，图5E）。

图5 G-Rh2对MS小鼠脂肪性肝炎的影响（n=5）Fig.5 Effects of G-Rh2 on steatohepatitis in MS mice（n=5）

2.6 G-Rh2对MS小鼠免疫系统的影响 与正常组比较，模型组小鼠脾脏中CD4+T 和CD8+T 细胞比例明显升高（P＜0.05），MDSCs 细胞数量有一定程度的下降。与模型组比较，G-Rh2 组小鼠脾脏中CD4+T细胞数量明显减少（P＜0.05）；CD8+T 细胞和NK 细胞数量有一定程度地下降，MDSCs 细胞数量明显升高（P＜0.01，图6A）。胸腺组织中CD4+T、CD8+T、NK和Treg细胞均无明显变化（图6B）。

图6 G-Rh2对MS小鼠体内免疫环境的影响（n=5）Fig.6 Effects of G-Rh2 on immune function in MS mice（n=5）

3 讨论

诸多研究报道人参皂苷G-Rh2具有治疗代谢性疾病的作用，可提高糖尿病大鼠胰岛素敏感性和葡萄糖代谢能力，促进前脂肪细胞3T3-L1 脂质分解代谢预防肥胖［14-16］，但是作用机制尚不清楚。本研究同样证实G-Rh2明显抑制MS小鼠肥胖和脂肪肝，并降低血脂TC、NEFA、LDL-C 水平。肝脏脂质代谢紊乱是引发高血糖、高血脂和肥胖等MS 系列症状的关键原因，一些药物可通过重编程肝脏脂质代谢治疗MS［17-18］。因此，本课题组利用脂质代谢组学探究G-Rh2 如何影响肝脏脂质代谢发挥治疗小鼠MS 的作用。结果表明经HFD 诱导的MS 小鼠肝脏中有大量脂质代谢物升高，最为显著的是TGs，而G-Rh2 降低MS 小鼠肝脏中多种脂质代谢物，包括TGs、DGs和PCs 等，说明G-Rh2 对脂肪肝的抑制与重塑肝脏脂质代谢模式有关。另外，有报道称与胰岛素抵抗患者相比，胰岛素敏感性患者的代谢产物中LPCs（C16：0）水平较高［19］；本研究同样观察到G-Rh2 升高肝脏中LPCs，推测G-Rh2 改善MS 小鼠胰岛素抵抗效应可能通过升高LPCs实现。

除机体代谢紊乱外，MS和肥胖患者通常还伴随慢性低度炎症，他们的代谢器官肝脏和脂肪组织中存在大量的免疫细胞和细胞因子，如巨噬细胞、T 细胞、肥大细胞，炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α 和趋化因子CCL2、CXCL10［20-23］。MDSCs 在MS 疾病环境中具有降低免疫反应的作用，CD11b+Gr-1+髓样细胞在高血压小鼠外周血中增加，通过产生过氧化氢来抑制T 细胞活化，从而限制炎症反应和血压升高［24-26］。据报道G-Rh2 具有较强的抗炎活性，通过阻断MAPK 和NF-κB 信号通路抑制巨噬细胞激活和炎症因子产生［27］。本课题组也探究了G-Rh2 对MS 小鼠组织炎症及免疫系统的影响：给予G-Rh2 后，MS 小鼠肝脏中炎症细胞浸润减少，血清中炎症因子TNF-α、IL-6 水平降低，脾脏中CD4+T 细胞数量恢复至正常水平，MDSCs 数量增加。研究证实肝脏炎症与脾脏免疫状态密切相关，HFD 喂养的小鼠脾脏中T 细胞增殖加速和数量增加会导致脂肪性肝炎加重［28］。本研究观察到MS 小鼠脾脏中CD4+T 细胞和CD8+T细胞均明显升高，而G-Rh2 减少脾脏中CD4+T 细胞数量，增加MDSCs数量，说明G-Rh2限制脾脏中T细胞过度激活和增加MDSCs 细胞，有利于肝脏恢复免疫平衡。

MS患者脂质代谢和免疫相互影响，脂质代谢紊乱易导致免疫失衡引发肝脏炎症，而炎症反过来造成肝损伤，干扰其代谢功能，形成恶性循环［29］。有研究报道暴露于断奶后肥胖饮食的雌性C57BL/6J小鼠后代显示出肝损伤的迹象，暴露于母体肥胖会加剧肝脏炎症性损伤，ALT、TGs、IL-6、TNF-α 在肝脏中的含量增加［30］。G-Rh2 减少肝脏炎症细胞聚集，调节脾脏中CD4+T/MDSCs 细胞比例平衡并降低炎症因子IL-6、TNF-α 水平，这对抑制肝脏炎症性损伤有重要意义，同时G-Rh2 改变了肝脏的脂质代谢模式，尤其是减少TGs、DGs和PCs的过度堆积，有利于防止脂肪肝的形成。但是由于脂质代谢和炎症存在相互影响的关系，本研究尚不能确定G-Rh2 是通过解除代谢紊乱环境避免了炎症反应，还是通过抑制炎症进而改善肝脏代谢紊乱及高血脂、胰岛素抵抗、肥胖等MS症状。

综上所述，本研究发现G-Rh2 有改善胰岛素抵抗、肥胖和降血脂的作用，可用于治疗MS 的高血糖、高血脂、肥胖、脂肪肝等系列症状，机制可能是通过调控MS 小鼠免疫失衡阻止肝脏炎症性损伤，同时重塑脂质代谢从而发挥治疗MS的作用。