DKK-1在类风湿关节炎治疗中的研究进展①

王颖旎 武 平 余泽芸 罗 云 （成都中医药大学针灸推拿学院，成都 610075）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性全身性的自身免疫性疾病，早期可出现骨侵蚀，逐渐恶化引发关节损害，导致患者关节功能受损、生活质量下降，其致残率高达60%～80%［1-3］。RA发病机制尚不明确，妇女、吸烟者和有家族史者最易受影响［4］。近年来，骨代谢机制及其与RA相关的细胞和分子基础已成为研究热点，骨骼质量及结构完整性受骨内稳态影响。RA 骨丢失是由于破骨细胞吸收骨量与成骨细胞形成骨量失衡所致［5］。研究发现Wnt/β-catenin 信号通路是成人关节软骨与退行性软骨组织的关键调节器，参与细胞增殖、胚胎发育和干细胞维护等生物学过程。经典Wnt传导通路受到多种细胞因子调节，同时与破骨细胞、成骨细胞及滑膜成纤维细胞密切相关，在RA 骨代谢中扮演重要角色［1，6］。Dickkopf-1（DKK-1）作为Wnt/β-catenin 途径的关键性调节因子受到广泛关注，在RA骨代谢机制中尤为重要，可作为调节Wnt信号通路的潜在治疗靶点，从而对RA 患者的骨丢失起保护作用。本文主要探讨Wnt信号通路及其负调蛋白DKK-1 在RA 中的作用，以及DKK-1 在RA 治疗中的研究进展，以期为RA的临床治疗提供新思路。

1 DKK-1蛋白结构及生物学特征

DKK-1 属于富含半胱氨酸蛋白（Dickkopf）家族，1998 年发现于非洲蟾蜍胚胎细胞中，并对胚胎中头颈部形成的诱导有显著影响［7］。缺乏DKK-1可导致头部和四肢发育不足［8］。位于人类10 号染色体10q11 上的DKK-1 基因，其编码的分泌性糖蛋白内含266 个氨基酸，包括31 个氨基酸组成的N 端信号肽段、2 个半胱氨酸富集区（Cys-1、Cys-2）以及具有糖基化作用的C 端，全长为3 377 nt［9］。DKK 家族由225～350 个氨基酸残基组成，主要含DKK-1、DKK-2、DKK-3、DKK-4 4 种分泌蛋白。其中DKK-1/2/4 主要参与经典Wnt 信号通路调控，DKK-1/4 对经典Wnt 信号通路主要起拮抗作用，DKK-1 的作用稍强，DKK-2 则根据细胞环境对Wnt 信号通路起激动或拮抗作用，DKK-3 尽管不参与经典Wnt 信号通路的调控，但对肿瘤的发生发展有着重要影响，能负性调节β-catenin 及其下游信号通路，抑制肿瘤增长与迁移，加速肿瘤细胞凋亡［10］。而DKK-1 可加强滑膜成纤维细胞血管生成和软骨降解活性，导致滑膜血管生成和软骨破坏［11］。

因此，DKK-1 作为Wnt 信号通路的主要负调蛋白，其过度表达可影响成骨细胞活性，加速骨破坏进程，在骨代谢方面起着重要作用。

2 Wnt/β-catenin信号通路

Wnt 基因首先在果蝇胚胎发育研究中被发现，也有研究发现鼠类乳腺癌病毒诱导的小鼠乳腺癌中克隆出一种原癌基因-Int-1 基因与果蝇胚胎无翅基因为同源基因，故将两者命名为Wnt［12-14］。Wnt/β-catenin 信号通路是复杂的蛋白信号网络，主要分为经典Wnt信号通路和非经典Wnt信号通路。目前研究发现，Wnt信号通路在细胞生长分化、肿瘤发育及骨代谢等方面都有特殊的影响［15-16］。DKK-1 主要作用于经典Wnt 信号通路，起到拮抗该通路作用。经典Wnt 通路的激活由β 蛋白（β-catenin）转换而来，可促进新骨生成，Wnt配体与靶细胞表面的低密度脂蛋白相关受体蛋白5/6（LRP5/6）家族、卷曲蛋白（Frizzled）家族相结合，形成二聚体，激活经典Wnt 通路［17］。当经典Wnt 通路被激活时，β-catenin在细胞内大量积聚，通过核易位与转录因子（TCF）/淋巴增强因子（LEF）结合，并激活基因转录，进而影响成骨细胞和破骨细胞［18-19］。当Wnt 通路受到抑制时，骨形成受到影响，导致关节破坏和变形。

因此，经典Wnt 信号通路在骨细胞的分化和成熟中发挥重要作用，激活该信号通路可加快骨细胞的分化速度，促进新骨生成，而抑制该信号通路可加速细胞的凋亡，导致关节软骨破坏甚至畸形，所以维持Wnt信号通路的功能正常在骨代谢相关疾病中尤为重要。

3 DKK-1/Wnt与RA

3.1 DKK-1 与RA 的相关性 RA 是临床常见的自身免疫性疾病，其病程进展中的骨代谢异常可引起骨糜烂和骨缺失。目前研究发现过度分泌的炎症细胞因子持续刺激滑膜细胞，引发胞内蛋白激酶持续被激活，导致滑膜细胞功能障碍，是RA 关节僵硬、畸形的主要原因［20］。有研究发现，在RA 炎症高峰期，骨侵蚀部位有DKK-1 蛋白表达，在RA 中DKK-1 是抑制骨生成而造成骨质流失和骨破坏的重要指标［21-22］。国内临床流行病学研究表明，RA 患者血清中DKK-1 表达较健康人显著升高［23］。RA 患者血清中DKK-1 上升，与骨结构改变、骨密度降低、关节损伤相关［24］。国外临床研究同样显示，DKK-1在血清中水平越高，RA患者关节功能越差［25］；DKK-1含量与疾病活动度呈正相关［24］。JUAREZ 等［26］研究发现，DKK-1 的差异表达在RA 早期中被检测到，表明DKK-1 过度表达可能是RA 进展中一个关键因素，并发生在疾病早期。同样在TNF 驱动的RA 模型中，DKK-1 拮抗剂可防止骨侵蚀并增加骨膜骨形成，提示中和DKK-1 生物活性可能抑制RA 骨侵蚀［23］。

上述研究表明，血清中DKK-1 水平与骨结构改变、骨密度降低、关节损伤相关；DKK-1 血清水平越高，RA 患者关节功能越差，其在成人骨量及关节重塑方面起着负面作用。因此，通过抑制DKK-1 的表达，支持骨修复的合成代谢微环境的生成，或可成为治疗RA的靶点之一。

3.2 DKK-1 对Wnt 的调控机制 经典Wnt 信号通路对骨代谢起关键作用，与骨发育、骨组织内稳态等密切相关，该通路的激活可诱导转录因子的表达，促使成骨细胞分化［27］。DKK-1 属于Dickkopf 家族，其基因散在分布于Wnt通路组件的上游，可通过与LRP5/6 结合，阻止Wnt-Frz-LRP5/6 复合物的形成，阻碍Wnt 信号通路的激活，抑制新骨形成［28-29］（见图1）。骨内微环境处于动态平衡状态，DKK-1过度表达可导致骨内微环境失衡，抑制成骨细胞进一步分化，导致骨生成障碍，加速骨丢失，即在炎症过程中，骨生成被抑制。DKK-1 是成骨细胞介导骨生成过程的重要负调蛋白，通过对Wnt/β-catenin 信号通路的负调节作用而封锁成骨细胞的分化，同时通过与骨保护素/核因子受体激活剂/前体细胞表面受体轴的“交互对话”效应，促进破骨细胞的成熟，打破骨代谢的平衡稳态，加重骨破坏［30-31］。因此，通过下调DKK-1 的表达水平来维持骨内环境的稳定，可为炎症等引起的骨丢失提供新诊疗思路。

图1 WNT/DKK-1的作用机制Fig.1 Mechanism of action of WNT/DKK-1

3.3 Wnt与RA 的相关性 经典Wnt信号通路影响骨骼发育及控制软骨和骨转换过程，对骨代谢的动态平衡调节至关重要，RA 的骨丢失正是由于这种平衡被打破所致［5］。故在RA 骨平衡方面，激活Wnt信号通路可诱导成骨细胞的成熟及分化，封锁破骨细胞功能，从而使侵蚀骨得到修复［32］。此外Wnt 信号通路也参与RA 炎症反应，成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes，FLS）是RA 最重要的病理特征，在RA患者滑膜的FLS内有许多与骨侵蚀相关的炎症因子，促进细胞基质降解，导致软骨和骨的持续性破坏。Wnt 信号通路不仅可以通过调节FLS 中纤维连接蛋白的表达，也能引起炎症因子如IL-1、IL-6、TNF-α 等表达，介导RA 炎症反应。而炎症反应可以激活Wnt 信号通路，SAITO 等［33］研究表明，RA 炎症得到控制后，该信号通路中负调控因子数量明显减少。MATZELLE 等［34］发现，关节骨糜烂的修复发生在炎症消退的背景下，并伴随Wnt 信号通路的改变。

RA 作为炎症关节疾病，其病情进展与滑膜的慢性炎症密切相关，FLS 产生的炎症因子可引起不同程度骨质破坏。因此，经典Wnt 信号通路不仅在RA 骨代谢方面有着极大影响，也在炎症机制方面与RA关系密切。

4 关于DKK-1的靶向治疗

在RA 骨破坏过程中，Wnt/β-catenin 信号通路在关节损伤及修复过程中起关键作用，如何使骨内环境维持稳定成为治疗RA 的关键。近年来，越来越多的有关RA 治疗的研究指向经典Wnt 信号通路的负调蛋白-DKK-1。

4.1 现代医学治疗 POLZER 等［35］的研究中，通过对RA小鼠进行抗DKK-1抗体治疗后，发现抗DKK-1抗体可防止骨糜烂，促进骨赘形成，激发骨重塑。目前西医针对DKK-1 的靶向治疗多采用生物疗法，研究表明生物治疗能够减缓骨破坏，抑制RA 的放射学进展，这种效应可能与Wnt 信号有关［36］。而生物治疗多集中在TNF-α 抑制剂，IL-1 受体拮抗剂（IL-1Ra）及anti-IL-6 单克隆抗体。在研究中，一些学者发现，DKK-1 缺失的小鼠模型中DKK-1 表达的减少可引起骨量显著增加，DKK-1 抗体可使RA 小鼠的骨溶解转换为骨生成，而TNF-α 抑制剂可使患者血清中DKK-1 水平显著降低［28，37-38］。ADAMI 等［37］发现在anti-TNF-α 治疗6 个月后RA 患者血清中DKK-1 含量减少（大多数患者采用阿达木单抗和赛妥珠单抗治疗，较少患者采用依那西普，英夫利昔单抗和高利单抗治疗）。FASSIO 等［38］发现予以RA患者TNF-α 抑制剂--赛妥珠单抗（CMZ）治疗2 个月后，RA 患者血清DKK-1 含量快速下降，骨吸收减少，骨形成增加。表明在以TNF-α为靶点的抗TNF-α疗法中，患者血清中DKK-1 水平均显著降低，关节疼痛减轻，提示抗TNF-α 治疗不仅具有显著的抗炎镇痛作用，还能提升RA 患者成骨能力，改善骨内微环境稳态，减少骨丢失，延缓骨破坏进程。其次，在BRIOT 等［39］为期一年的前瞻性开放研究中也发现，接受抗IL-6 单克隆抗体托西珠单抗（TCZ）和甲氨蝶呤（MTX）治疗后的RA 患者，血清DKK-1 水平显著下降，骨形成标志物升高。即IL-6 可通过调节破骨细胞的激活和分化来促进全身骨吸收，而TCZ 作为IL-6 受体抑制剂，可通过显著减少骨髓中破骨细胞前体的数量来防止全身性骨丢失，抑制骨吸收，骨形成标志物升高。还有WANG 等［40］在研究中采用TNF-α抑制剂英夫利昔单抗（infliximab）和IL-1受体拮抗剂阿那白滞素（IL-1Ra）治疗RA 患者，观察到RA 患者血清中DKK-1 含量显著下降。表明IL-1Ra作为内源性的IL-1抑制剂，可与IL-1受体竞争，阻止IL-1 信号转导，抑制IL-1 介导的滑膜炎症和关节破坏。另外，ZHANG 等［41］发现重组人DKK-1 多表位DNA 疫苗可诱导特异性抗体，可有效中和DKK-1 生物学活性，减轻CIA 小鼠的骨损伤，也可能为RA 治疗提供一种新的方法。

由于RA 关节僵硬畸形与炎症密切相关，以上生物疗法选用促炎因子抑制剂，如TNF-α 抑制剂，IL-1 受体拮抗剂及anti-IL-6 单克隆抗体等，通过抑制相关炎性因子降低血清中DKK-1 水平，阻止骨破坏，从而抑制关节结构性损伤，激发骨重塑。研究表明，生物疗法对改善RA 患者关节的疼痛肿胀、僵硬畸形等方面具有一定的疗效。但是，生物疗法毒副作用较大，患者需要长期治疗，易引起肝肾功能、胃肠系统损害，以及价格昂贵等弊端，多数患者难以负担。因此，临床急需寻找安全有效的治疗方法。

4.2 中医中药治疗 中医在RA 的治疗中有其独特优势，有研究表明，中医治疗RA 具有良好的抗炎镇痛疗效及免疫调节作用，能延缓病情发展，具有毒副作用小，价格低廉等特点，是一种理想治疗方法［42-45］。杨锋等［46］通过实验发现活血化瘀中药可下调DKK-1 表达，调节Wnt/β-catenin 信号通路来增强成骨细胞活性以促使新骨生成。李波等［44］通过分析清热活血方药对类风湿性关节炎大鼠Wnt/βcatenin 信号通路相关因子表达的影响，发现清热活血方药可以有效下调CIA大鼠滑膜DKK-1表达和血清DKK-1 含量，在CIA 大鼠骨破坏过程中发挥骨保护作用。那仁满都拉等［47］采用具有清热、止痛、消肿功用的蒙药森登-4汤观察CIA 大鼠踝关节组织病理学改变，发现高剂量蒙药森登-4 汤能显著下调大鼠爪关节DKK-1 蛋白表达，有明显的骨破坏抑制作用。蔡叙东等［45］认为破骨细胞是参与RA 骨破坏的主要细胞，断藤益母汤对破骨细胞的活性具有抑制功效，且药物浓度越高，抑制功效越显著。断藤益母汤可通过影响Wnt/β-catenin 信号通路，上调Wnt3a、β-catenin 蛋白表达，下调DKK-1 蛋白表达、抑制破骨细胞成熟，延缓RA 的骨破坏进程。上述研究表明，清热活血化瘀药物能够通过调节血清DKK-1 含量，作用于Wnt/β-catenin 通路，减缓RA 患者骨破坏进程。

也有研究选用由黄芪、白术、龙胆草等组成的类风湿Ⅰ号方观察经治疗后的佐剂型关节炎大鼠（adjuvant arthritis，AA）血清DKK-1 含量，发现类风湿Ⅰ号可有效下调DKK-1 表达，维持Wnt 信号通路平衡［48］。董壮［49］通过实验发现尖叶假龙胆与秦艽配伍可降低CIA 大鼠血清DKK-1 的水平，使之趋向正常。其作用机制可能是对Wnt/β-catenin 信号通路的调节作用，减少骨破坏。上述研究表明，健脾除湿药物除可显著缓解RA 患者关节疼痛等症状，亦可通过调节血清中DKK-1 的含量，作用于Wnt/βcatenin通路，延缓RA骨破坏进程。

另外，赵慧等［50］通过观察由阳和汤化裁而来的补肾通督胶囊对肾虚寒凝型RA 患者DKK-1 的影响，补肾通督胶囊能减少血清DKK-1 含量，减少对Wnt信号通路的拮抗，使骨形成增加。肾主骨生髓，肾虚补督壮骨，则可化气布精，充养四肢百骸，经络通而痹证除。即补肾壮骨药物能减轻DKK-1对Wnt信号通路的传导阻滞，使骨形成增加。

上述研究表明，中医中药可通过清热活血化瘀、健脾除湿及补肾壮骨等方面对RA 发挥治疗效果，其主要机制可能与下调DKK-1 表达，调节Wnt/β-catenin 信号通路，从而增强成骨细胞活性，促使新骨生成有关，最终达到减轻RA 关节疼痛肿胀，调节免疫，修复软骨，延缓关节变形等作用。

4.3 针灸治疗 中医针灸对RA 也有较好的抗炎镇痛疗效及免疫调节作用，相关的实验研究和临床研究证实，针灸能延缓RA 病情发展，改善临床症状［51-53］。但关于针灸干预DKK-1 的相关研究较少，研究多集中在中草药方面。针灸作为在传统中医理论指导下的一种外治疗法，针刺或艾灸相应腧穴同样能起到活血化瘀、健脾除湿、补肾壮骨等作用，且艾灸具有操作简单方便，毒副作用小，价格低廉，疗效好及收效快，患者易于接受等特点。值得进一步的思考和探索。

综上所述，Wnt/β-catenin 信号通路不仅能促使TNF-α、IL-6 等炎症因子表达，介导RA 炎症反应，亦可参与RA 骨代谢，对维持骨内微环境稳定发挥重要作用。DKK-1 作为该通路的负调节蛋白，可与LRP5/6 结合，阻止Wnt-Frz-LRP5/6 复合物形成，抑制该通路传导，影响新骨形成，破坏关节功能。故下调DKK-1 的表达水平以维持骨内环境的稳定，可能成为延缓RA 患者骨破坏的关键。由于DKK-1 在RA 治疗中的高靶向性，西医目前针对DKK-1 的靶向治疗多集中在TNF-α 抑制剂、IL-1Ra 及anti-IL-6等生物疗法上，对RA 患者病情的改善具有一定疗效，但因其价格昂贵，且有毒副作用，不宜长期应用。中医中药具有清热活血化瘀、健脾除湿以及补肾壮骨作用，能显著缓解RA 患者关节疼痛等症状，并可以通过调节血清中DKK-1 的含量，作用于Wnt/β-catenin 通路，使RA 骨侵蚀得到修复，值得进一步研究。针灸亦可起到活血化瘀、健脾除湿、补肾壮骨等作用，且作为外治疗法，有独特优势，可以长期应用于临床，因此更值得进一步研究。总之，将DKK-1 作为治疗RA 的刺激靶点，对DKK-1 的结构、作用机制及其对RA 的影响进行分析，探讨DKK-1在类风湿关节炎治疗中的研究进展，可为临床治疗RA提供新思路。