HPLC法测定荷芪煎煮茶中熊果酸的含量

肖海燕，迟玉霞，胡冬梅，高秀蕊，高翠芳，张霄汉

(山东药品食品职业学院，淄博 255000)

1 引言

中药荷芪煎煮茶是依据在临床上应用多年，并取得满意疗效的验方，经过研发制备的医院自制中药制剂，用于益气化浊，行瘀消积。荷芪煎煮茶由绞股蓝、黄芪、山楂、荷叶等组成[1]。对于现代中药制剂，处方组成、生产和销售等环节均需符合国家相关部门制定的中药制剂质量标准，因此需要相应方法来测定中药制剂中各种成分的含量。总体来说，在中药制剂的质量标准研究中，薄层扫描法、紫外分光光度法、气相色谱法和高效液相色谱(HPLC)法等都是较为常用的定性、定量检测方法，其中HPLC法具有快速分析、高灵敏度和高精确度的优点，是定量分析的主要方法[2-3]。为有效控制荷芪煎煮茶的质量，建立了HPLC法对制剂中熊果酸的含量进行测定；同时测定了不同产地山楂中熊果酸的含量，制定了山楂中熊果酸的含量限度[4-5]。

2 实验

2.1 仪器与试药

2.1.1 仪器日本岛津LC-20AT高效液相色谱仪系列；瑞士梅特勒托利多MS205Du电子天平(十万分之一)；KQ-400KDE型高功率超声波清洗器。

2.1.2 试药与样品含熊果酸荷芪煎煮茶样品；山楂饮片；缺山楂荷芪煎煮茶样品；UA对照品(110742-201823，含量99.9%)；德国默克色谱纯乙腈、分析纯乙

醇、分析纯磷酸；娃哈哈纯净水。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备

取熊果酸对照品(UA，下同)适量，用乙醇制成每1ml含80μg的溶液即得。

2.2.2 供试品溶液的制备

称取约3 g本品，研细后放置于100 mL具塞锥形瓶中，移取25 mL乙醇，称重后在300 W，45 kHz频率下超声处理30 min，放冷后向锥形瓶中再次加入乙醇至超声前所称重量，摇匀过滤后取续滤液即可。

2.2.3 阴性样品溶液的制备

取不含山楂的阴性样品，按2.2.2项下方法制成阴性样品溶液。

2.3 色谱条件考察

采用Agilent 1200-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，根据《中国药典》2020年版一部[1]和文献[2-5]，在检测山楂中UA含量时，采用的波长多为215 nm。流动相、柱温、流速和进样量分别为乙腈和0.05%磷酸(67：33)、40 ℃、1.0 mL/min和20 μL。

2.3.1 流动相考察

通过查阅文献[2-3]，不同制剂测定UA含量多采用乙腈-0.05%磷酸作为流动相，因此分别配置不同浓度的磷酸进行考察。对照品及TS进样量均为20 μL，检测结果见表1。

表1 流动相试验结果

在对流动相的分离度、拖尾因子和理论塔板数进行综合对比考虑后，综合考虑后选择乙腈-0.05%磷酸(67：33)作为流动相，符合《中国药典》2020年版高效液相色谱法(通则0513)。

2.3.2 提取溶剂的考察

通过查阅《中国药典》2020年版一部[1]和文献[2-4]，发现测定UA含量时通常使用的提取溶剂为乙醇和甲醇，因此，分别用乙醇、无水乙醇及甲醇为例进行提取溶剂的考察。按2.2项下方法分别用上述三种溶剂制备TS，均作平行样。

平行制作6份RS样品和上述三种TS样品各20 μL，使用HPLC测定，用外标法计算含量。结果见表2。

表2 提取溶剂试验结果

由三种溶剂含量测定结果可知，甲醇、无水乙醇溶剂结果相近，乙醇溶剂含量略高，考虑到环保因素，故确定以乙醇作为提取溶剂。

2.4 方法学考察

按2.2项下方法制备对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液，分别吸取各20 μL，使用HPLC进行测定，结果见图1。

图1 专属性的HPLC色谱图(上图UA对照品色谱图，中图样品色谱图，下图阴性对照色谱图)

结果显示，在阴性对照品色谱图中含有除UA外所有其他物质的色谱峰，这说明荷芪煎煮茶处方中的其他物质不会对HPLC测定结果产生干扰。

2.4.2 线性关系考察

按2.2项下方法制备UA对照品溶液，分别精密量取1 mL置10 mL量瓶中，3 mL置20 mL量瓶中，2 mL置10 mL量瓶中，5 mL置20 mL量瓶中，3 mL置10 mL量瓶中，分别加乙醇稀释至刻度，制成6种浓度溶液。各吸取10 μL，分别以UA对照品进样量和峰面积为横、纵坐标进行线性回归得到回归方程，回归方程y=399163 x-292.51，相关系数r=0.9999。结果显示，当UA浓度在37.6 μg·mL-1～112.9 μg·mL-1的范围内进样量与峰面积的线性关系良好。

2.4.3 精密度考察

精密吸取按2.2项下方法制备UA对照品溶液20 μL，平行测定6次，记录色谱图。UA的RSD为0.076%，表明仪器精密度良好。

2.4.4 稳定性考察

取本品适量，按2.2项下方法制备TS，在0 h、2 h、4 h、8 h、24h，分别进样20μL并测定UA的峰面积，观察TS在检测过程中UA的稳定性。RSD为0.56%，结果显示，TS在24 h内稳定性良好。

式中，Y为社会总产出；A 代表技术进步水平；L 为劳动力投入；K 为资本投入；参数α和β分别表示资本和劳动力的产出弹性。假设各地区生产函数遵循规模报酬不变的C-D生产函数，即α+β=1。

2.4.5 重复性考察

按照2.2项下方法制备制备RS和TS(平行制备6份)，吸取各20 μL，测定UA含量，UA的RSD为0.61%，结果表明方法重复性良好。

2.4.6 加样回收率考察

取已测知含量的本品适量(批号：030502)，约1.5 g，精密称定，分别精密加入UA对照品溶液(79.68 μg·mL-1)15 mL及乙醇10 mL，按正文中含量测定方法测定，计算回收率。平行制作6份，计算回收率。结果平均回收率为100.6 %，RSD为0.34 %(n=6)。

2.5 样品含量测定

按前文方法和条件，使用HPLC测定3批荷芪煎煮茶中的UA含量。按2.2项下方法制备RS，TS，取本品然后按照上述溶液制备方法制备。

吸取RS及TS各20 μL，使用HPLC用外标法计算UA含量。结果见表3。

表3 熊果酸含量测定结果

2.6 不同产地山楂中UA含量测定

因山楂为《中国药典》2020年版(一部)收载的品种，但含量采用的是容量分析测定有机酸含量，因此按上述含量测定方法，对八批不同产地的山楂样品进行熊果酸含量测定。色谱图见图2，结果见表4。

图2 山楂HPLC色谱图

表4 8批不同产地山楂熊果酸含量测定结果

3 结果与讨论

3.1 本试验采用HPLC法测定荷芪煎煮茶中熊果酸含量，方法简便，测定结果准确可靠，可作为该制剂的含量测定方法。

3.2 参考以熊果酸为山楂测定指标的相关文献，对多种流动相进行了选择，最后确定流动相为乙腈-0.05% 磷酸(67：33)，熊果酸峰形对称，样品分离良好。

3.3 因为《中国药典》2020年版一部收载的山楂含量是采用酸碱滴定法测定有机酸含量，因此根据以上8个不同产地山楂中熊果酸含量测定结果，故规定山楂饮片在符合《中国药典》2020年版一部要求外，还需采用HPLC法测定山楂中熊果酸含量。考虑到产地及批与批可能存在的含量差别，故定山楂按干燥品计算，含熊果酸(C30H4803)不得少于0.18 %。

3.4 根据样品和山楂含量测定结果，暂定每袋荷芪煎煮茶中含山楂以熊果酸计，应不得少于9.0 mg。

4 结论

采用本方法测定荷芪煎煮茶中熊果酸含量，方法简便，测定结果准确可靠，可作为该制剂的含量测定方法，同时本方法可用作山楂中熊果酸含量测定方法。