液相色谱-原子荧光联用仪测定赖氨酸硫酸盐中无机砷含量的不确定度评估

◎ 陆秀军，王智亮，孙世杰

（1.赤峰市松山区疾病预防控制中心，内蒙古 赤峰 024000；2.赤峰海关综合技术服务中心，内蒙古 赤峰 024000）

砷元素广泛存在自然界中，是毒性较大的有害元素，受到人们的广泛关注，也成为饲料安全重点检测的项目。对砷的毒性作用机理研究表明，砷的毒害主要取决于它的化学形态，不同的化学形态呈现出极大的毒性差异，经过大量实验研究，三价无机砷的毒性强于五价无机砷，五价无机砷强于有机砷，长期过量摄入三价无机砷不利于身体健康。

自然界中的砷有有机砷和无机砷两种形式，有机砷可用于抗生素促生长类饲料添加剂，对于提高畜禽的饲料利用率、增强抗病能力有着明显作用，现代动物营养学研究中被认为和硒碘一样，是动物机体的一种必需元素。但无机砷却是一种有毒有害元素，对畜禽等动物的危害性很大，饲料卫生标准中对无机砷有严格的限制要求，即≤2.0 mg·kg-1[1]。因此，饲料中无机砷的检测结果正确性要求是重中之重，但检测结果不可避免会产生误差。对不确定度的分析可以在实验测试过程中有效提高检测质量水平。本次实验使用液相色谱-原子荧光联用仪对三价无机砷含量进行测定，并对整个测量过程中三价无机砷的不确定度来源进行分析。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

磷酸二氢铵（NH4H2PO4）、硼氢化钾（KBH4）、氢氧化钾（KOH）、硝酸（HNO3）、盐酸（HCI）和氨水（NH3·H2O），以上试剂除了有特殊要求外均使用优级纯。三价砷标准品（纯度为≥99.5%）。C18色谱柱、北京宝德BSA-100A/B/C液相色谱-原子荧光联用仪。

1.2 试验方法

1.2.1 试验原理

试样经稀硝酸酸化提取，在液相条件下进行分离，用分离后所获得的物质在酸性条件下再与硼氢化钾（KBH4）反应生成气态氢化物，用高纯氩气作为载气，进入原子荧光光谱仪原子化器进行检测，采用外标法定量[2]。

1.2.2 试验步骤

准确称取1.0 g（精确至0.001 g）赖氨酸硫酸盐试样，置于50 mL聚四氟乙烯塑料离心管中，加20 mL硝酸溶液（0.15 mol·L-1），浸泡过夜。置于90 ℃恒温箱中，热浸提2.5 h，每隔30 min取出振摇1 min。提取完毕后，取出冷却至室温，置于8 000 r·min-1离心机中离心15 min，取上清液，经0.45 μm水相滤膜过滤后进样测定。按同一方法做空白实验。

1.3 数学模型

采用外标法定量计算无机砷的含量，计算公式为：

式中：X为无机砷含量，mg·kg-1；CAs3+为测定液中扣除空白后无机砷的浓度，mg·L-1；V为试样消解后定容体积，mL；m为试样质量，g。

2 三价砷引入不确定度分析

2.1 试样制备过程中引入的不确定度

（1）称重所用天平（0.001 g）的扩展不确定度为0.002 g，取包含因子k=2，则天平所产生的标准不确定度为[3]：

（2）容量允差。查《常用玻璃量器》（JJG 196—2006）[4]，25 mL(A级)的容量瓶在20 ℃时，容量允差为±0.030 mL，取均匀分布，则所带来的不确定度为[6]：

（3）试样制备过程中引入的合成不确定度为：

2.2 标准物质

2.2.1 标准储备液的不确定度

所购买三价砷标准品的纯度为99.5%。纯度为0.5%的分散，其半宽为0.25%，三价无机砷标准储备液的标准不确定度为：

三价无机砷标准储备液的相对标准不确定度为：

2.2.2 标准溶液稀释引入的不确定度

（1）标准溶液的稀释步骤。准确吸取标准储备液（100 mg·L-1）于100 mL容量瓶（A级）中，用纯水定容至刻度[6]。此标准使用液浓度为1 mg·L-1。取7支10 mL容量瓶，准确加入0 mL、0.50 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.30 mL、0.50 mL和1.00 mL，用纯水稀释，此方法标准溶液的浓度依次为 0 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、30 ng·mL-1、50 ng·mL-1和100 ng·mL-1。

（2）移液器引入的不确定度。查《可调移液器试行检定规则》（JJG 646—2006）[5]，所用100 μL移液器在使用100 μL量程时，容量允差为±2.0%（容量允差包含体积校准、满载液体至移液器刻度的变动性、操作员读数）则100 μL移液器引入的不确定度为：

所用1 000 μL移液器在使用1 000 μL量程时，容量允许差为±1.5%（容量允差包含体积校准、满载液体至移液器刻度的变动性、操作员读数），则1 000 μL移液器引入的不确定度为：

（3）容量瓶体积的不确定度。查《常用玻璃量器》（JJG 196—2006）[4]，10 mL容量瓶（A级）在20 ℃时，允差为±0.020 mL，取均匀分布，则不确定度为[6]：

（4）纯水在实验室温度变化（20～25 ℃）时的体积膨胀系数为2.1×10-4℃，温度相差3 ℃，k=1.960。温度引入的相对不确定度为：

2.2.3 标准物质的相对标准不确定度urel(std)

三价无机砷标准物质相对不确定度为：

2.3 重复性试验的不确定度

准确称取试样5份，同时进行试样处理，在相同仪器条件下测定三价砷浓度，试样数据和结果，见表1[7]。

表1 试样数据表

三价砷单次测量的不确定度为：

5次测定三价砷含量平均值的相对不确定度为：

2.4 标准曲线拟合产生的不确定度

使用5个浓度点的三价砷标准溶液数据x和相应的峰面积强度值y，进行一次方程拟合，拟合得到校正标准曲线：y=54 535x-52 764，则a=52 764，b=54 535，R2=0.992。共5个标准曲线浓度值，重复测2次，则P=10，则C的标准不确定度为：

则三价砷的不确定度为：

3 合成标准不确定度

三价无机砷的合成不确定度：

4 扩展不确定度

试样中三价无机砷含量的扩展不确定度，取包含因子k=2，扩展不确定为U=2×u(x)=2×0.000 730=0.001 46 mg·g-1。

5 结论

通过不确定度分量的评估可以得出结论，对合成相对不确定度贡献最大的分量为试样制备过程及校准曲线拟合引入的不确定度分量。试样制备过程和校准曲线的配制及拟合对于每一位检测技术人员的操作水平有很高的要求，因此实验人员的操作手法和熟练程度能够显著降低试验过程中带来的不确定度。