靶向超声介导携Pik3cb shRNA的超顺磁性氧化铁纳米微泡抑制血管平滑肌细胞增殖

王宇豪，马小五，方玲玲，李林，李妙，张平洋

南京医科大学附属南京医院（南京市第一医院）心血管超声科，江苏 南京 210006；*通信作者 张平洋 zhpy28@126.com

血管再狭窄（in-stent restenosis，ISR）是冠状动脉介入手术常见的并发症。随着新一代支架和支架技术的发展，冠状动脉发生狭窄的治愈率得到有效提高，致死率明显降低，但仍容易发生ISR等并发症，导致预后不理想。尽管最新的药物球囊支架已将ISR的发生率降至20%以下，但仍处于较高水平[1-2]。目前发生ISR的具体机制尚未明确，除可能与支架直径、长度、患者的基础性疾病以及介入手术中的机械性损伤有关外[3]，在ISR的发生过程中，血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）的增殖和迁移是导致内膜增生的主要机制[4]。

Pik3cb基因编码磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）的一种催化亚基p110β，人体内普遍存在p110β表达，而PI3K/Akt通路与VSMC增殖密切相关[5]。纳米微泡具有良好的生物相容性和稳定性，是靶向药物运输的理想平台，经过修饰后可以负载治疗性小分子药物，实现靶向药物的运输[6-7]。超顺磁性氧化铁纳米颗粒（superparamagnetic iron oxide，SPIO）是合成的小分子γ-Fe2O3或Fe3O4颗粒，常用于MRI的增强造影剂[8]。此外，通过SPIO的磁特性，可以利用外部磁场的导向作用，使SPIO发生移动并富集，从而将与其相结合的药物运输到体内特定部位[9-10]。本研究拟使用SPIO制备的新型磁性纳米微泡为载体，以Pik3cb基因为靶点，通过抑制p110β的表达，从而实现抑制VSMC异常增殖。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂 主要试剂：Pik3cb质粒和错配质粒（广州锐博生物科技公司）；SPIO纳米颗粒（南京东纳生物科技公司）；磷酸化Akt抗体、β-actin抗体（Cell Signaling Technology）；ECL底物试剂盒（Biovision）；DAB显色试剂盒（武汉博士德公司）；三氯甲烷、Span80、聚乙烯醇等购自上海爱必信生物科技有限公司。主要仪器：小动物超声成像仪Vevo2100（VisualSonics）；2F球囊导管（Edwards Lifesciences）；库尔特颗粒分析仪（Beckman Coulter）；光学显微镜（OLYMPUS）；数字水浴箱（Benchmark）。

1.2 纳米微泡制备及检测

1.2.1 SPIO-shPik3cb的制备 通过反相微乳法制备，步骤：室温下称取适量聚乳酸，加入10 ml三氯甲烷，待完全溶解后加入适量SPIO纳米颗粒与超纯水，于60°C水浴箱中混合均匀，加入适量山梨糖醇酐单油酸酯（Span80）和去气超纯水，在通入SF6气体的条件下，利用超声探头持续处理5 min后，转入羧基修饰的5%聚乙烯醇溶液（PEG）中，机械振荡4 h，差速离心法收集得到表面羧基修饰的磁性纳米微泡。利用静电吸附原理负载质粒shRNA，离心去除上清后，用1 ml PBS稀释，得到携Pik3cbshRNA的超顺磁性氧化铁纳米微泡（SPIO-shPik3cb），用灭菌纯水重悬，4℃条件下用玻璃试管保存。

1.2.2 磁性纳米微泡和SPIO-shPik3cb的表征检测 取适量上述样品，用库尔特颗粒分析仪检测平均粒径；在扫描电子显微镜下观察其形貌。

1.2.3 SPIO-shPik3cb结合质粒的能力检测 取10 μl上述样品，计算质粒shRNA含量（约350 ng），另取1.5 μl裸质粒，加PBS液稀释至10 μl。在110 mV条件下，进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4 体外超声成像效果和靶向性评价 为了研究SPIO-shPik3cb在外部超声下的成像效果与在外部强磁场作用下的靶向性，分为生理盐水对照组和SPIOshPik3cb组，将等量生理盐水、SPIO-shPik3cb溶液分别加入1.5 ml EP管中，选用小动物超声成像仪Vevo2100，超声频率设置为18 MHz，将探头放置在试管表面，观察探测区域内有无白色气泡点出现。将圆形永磁铁放在试管底部附近5 min，观察探测区域内白色气泡点的分布情况。

1.3 动物体外实验

1.3.1 实验动物建模 40只SPF级雄性SD大鼠，体重（200±20）g，由南京医科大学附属南京医院实验动物中心提供[动物许可证编号：SYXK（苏）2016-0006]。研究人员均严格遵循动物实验伦理规定。所有大鼠适应性喂养1周后，术前用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，取颈部正中切口，钝性分离皮下组织，避免损伤伴行神经，暴露出右侧颈总动脉，用动脉夹夹闭右侧颈总动脉近心端和右侧颈内动脉起始处，沿右侧颈外动脉将球囊导管逆行插入，扩张球囊导管后缓慢拖拉以损伤内膜，重复3次后退出球囊导管。肝素生理盐水冲洗伤口，确认血流恢复后，进行逐层缝合。术后肌肉注射青霉素20万IU预防感染。

1.3.2 分组及转染实验 将上述建模成功的大鼠喂养2周后，随机选择并分为4组，每组6只。A组（SPIOshPik3cb组）经尾静脉注射0.2 ml SPIO-shPik3cb后行超声辐照。B组（建模对照组）经尾静脉注射等量生理盐水后行超声辐照。C组（SPIO-shcontrol组）经尾静脉注射等量空磁性纳米微泡和错配质粒混合溶液后行超声辐照。D组（Pik3cbshRNA组）经尾静脉注射等量Pik3cbshRNA后行超声辐照。实验过程中始终将圆形永磁铁置于各组大鼠右侧颈部皮肤下方。超声辐照参数：超声频率1 MHz，峰值负压强度0.6 W/cm2，占空比50%，照射时间为1 min，间隔30 s后重复3次。

1.4 新生血管观察及相关蛋白表达检测

1.4.1 组织学和形态学分析 转染实验14 d后，过量麻醉处死各组大鼠，取出损伤处的颈总动脉血管，用4%多聚甲醛固定，制成连续石蜡切片。行HE染色，在光镜下观察新生内膜增生情况，用Image-Pro Plus 6.0图文分析软件测量并计算内膜面积与中膜面积（I/M）比值。

1.4.2 Western blot法分析 将各组损伤处颈总动脉段剪碎，加入20 μl蛋白裂解缓冲液中，裂解30 min后，移至EP离心管离心15 min后取上清液。通过BCA法测定各组样品的蛋白浓度，行10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，灌胶、等量上样后，将各电泳条带转移到硝酸纤维素膜（PVDF膜）。室温下封闭60 min，先后与一抗、二抗孵育，洗涤；采用DAB试剂显色复染，最后将胶片扫描并拍照存档。

1.5 统计学方法 使用GraphPad Prism 5.0软件，计量资料以±s表示，组间比较采用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SPIO-Pik3cb的粒径分布及形貌 磁性纳米微泡的平均粒径大小为（143.60±18.27）nm（图1A），SPIOPik3cb的平均粒径大小为（151.45±11.18）nm（图1B）。负载质粒shRNA前后的微泡粒径未发生明显变化。扫描电子显微镜显示SPIO-Pik3cb为大小和分布较均匀的球形（图1C）。

2.2 SPIO-shPik3cb结合质粒的能力 1%琼脂糖凝胶电泳检测结果显示：Marker泳道条带清晰，DNA泳道为游离的质粒shRNA，显示有2个弥散的条带；SPIOshPik3cb泳道集中在加样孔附近。电泳结果显示Pik3cbshRNA与磁性纳米微泡成功结合（图2）。

2.3 体外超声成像效果和靶向性评价 在超声作用下，生理盐水组的探测区域内为纯黑色，无白色亮点出现（图3A），与生理盐水组相比，SPIO-Pik3cb组的探测区域内出现分布不均匀的白色亮点（图3B）。当加以外部强磁场5 min后，SPIO-Pik3cb组探测区域内的白色亮点趋向于试管底部（图3C）。

2.4 SPIO-shPik3cb可以抑制新生血管内膜增生 转染实验14 d后，HE染色显示各组大鼠血管内膜均发生不同程度增生（图4）。SPIO-shPik3cb组、建模对照组、SPIO-shcontrol组及Pik3cbshRNA组损伤血管I/M比值分别为0.48±0.08、0.96±0.12、0.89±0.05、0.66±0.07，与建模对照组相比，SPIO-shPik3cb组新生内膜增生和面积均明显减少（t=4.872，P＜0.05），见图5。

2.5 SPIO-shPik3cb抑制ISR的作用机制 Western blot显示SPIO-shPik3cb组和Pik3cbshRNA组的磷酸化Akt蛋白（p-Akt）表达量较建模对照组均有所下降，其中SPIO-shPik3cb能够明显下调p-Akt的表达，与SPIO-shPik3cb抑制损伤后血管内膜增生的结果相符（图6、7）。

3 讨论

3.1 基因治疗应用于心血管疾病的现状 VSMC异常增殖和迁移是导致新生内膜增生，继而引发ISR等一系列并发症的主要机制。ISR发生后，支架介入治疗的远期预后较为不理想。因此，急需寻找另一种可行的抗新生内膜增生的治疗方案。近年来，基因治疗作为一项新兴的技术，已用于研究心血管疾病及其相关临床并发症的防治中。RNA干扰是指由特定RNA诱发，可以在转录后水平降解靶基因的同源mRNA，进而沉默组织或细胞水平上目标基因的表达[11]。外源性治疗用核苷酸药物在到达靶细胞后，主要通过内吞作用进入细胞内，但往往需要到达细胞核才能发挥作用。在这个过程中，外源性治疗用核苷酸药物容易被血清中的核酸酶降解，导致其不能持续稳定地发挥作用，限制了其进一步临床应用。探索新型载体对实现靶向基因治疗有重要意义。

3.2 磁性纳米材料用作基因治疗载体的特点 以往临床试验中常用的载体通常是病毒载体和裸质粒[12]。随着纳米技术的发展，新一代磁性纳米材料在光热疗法、光动力疗法和磁热疗法等领域中均得到广泛应用[13-15]。PEG具有高亲水性和高生物相容性，是一种高效的结构稳定剂[16]。本研究制备的SPIO纳米微泡载质粒前后的平均粒径变化不大，依然维持在纳米范围内。琼脂糖凝胶电泳实验证实磁性纳米微泡与质粒可以紧密结合，在血液循环中具有较好的稳定性。体外超声成像实验中，SPIO-shPik3cb在磁场的作用下具有较好的靶向性，可以发生移动和团聚，提高靶区域内的药物浓度。在颈动脉球囊损伤大鼠模型中，通过尾静脉注射给药后，SPIO-shPik3cb可以在磁场的作用下到达损伤的血管壁附近，转染VSMC。与传统的微泡相比，基于超顺磁性材料的纳米微泡结构稳定、具有靶向性，在转染效率上更有优势，避免了大剂量用药的潜在副作用。

3.3 靶向超声介导SPIO-shPik3cb能够提高转染效率 PI3K IA型是被研究最多的PI3K家族里的同工酶，是由p85调节亚单位和p110催化亚单位组成的异源二聚体，磷脂酰肌醇二磷酸被转化为三磷酸肌醇。三磷酸肌醇是一种重要的第二信使，可以与蛋白激酶B即Akt结合，促使Akt从胞质转移到质膜，激活Akt蛋白上的丝氨酸磷酸化位点（Ser473）并使其磷酸化，继而调控一系列与细胞增殖、凋亡、自噬相关的蛋白[17]。本研究通过对编码p110 β亚单位的Pik3cb基因进行RNA干扰，下调PIK3/Akt通路的活性，最终抑制大鼠损伤血管的VSMC增殖。超声的空化效应是一种物理现象，液体中的空化核在声波的作用下产生振荡，当声压超过一定值时气泡发生破裂，泡内聚集的能量随即释放出来，导致细胞膜表面形成微小的声孔[18-19]。通过HE染色和Western blot发现，与裸质粒相比，SPIO-shPik3cb组抑制新生内膜增生的效果更明显，p-Akt的表达量也明显下降，在转染大鼠损伤血管壁后能有效抑制VSMC增殖的效应。可能是由于靶向超声的作用，SPIO-shPik3cb可以穿过微小的声孔进入细胞内，释放出携带的基因药物，实现对病变部位的靶向药物传递。

总之，本研究成功制备了SPIO-shPik3cb，在磁场引导作用下，可以靶向运输该磁性纳米微泡至大鼠损伤血管壁处，通过靶向超声介导基因转染，继而抑制VSMC增殖，以减轻新生内膜增生，这主要是通过下调Pik3cb蛋白表达实现的，为临床上血管增生型疾病如动脉粥样硬化和冠状动脉介入术后的ISR治疗提供了新的思路。本研究仍存在一定的不足之处，如未能明确其对血管外组织或器官是否有潜在的副作用，最新研究提示纳米复合物在体内的代谢场所主要位于肾脏和肝脏[20]，还需进一步研究验证。