山竹果皮中总氧杂蒽酮通过调控miR-338-3p抑制胃癌细胞AGS增殖、迁移侵袭及炎症反应的实验研究

王芬芬,王秀芳,胡剑浩,王银娟

王芬芬,王秀芳,胡剑浩,王银娟,绍兴文理学院附属医院消化内科 浙江省绍兴市 312000

0 引言

胃癌是临床常见的一种恶性肿瘤,其具有复发率高与死亡率高等特点,化疗、放疗等治疗手段具有毒副作用,患者易产生耐药性与抵抗性从而降低治疗效果,患者预后较差.从天然植物中提取的活性成分具有抗肿瘤作用,研究表明,部分中医药具有抗胃癌作用.山竹又称山竹子,山竹果皮中含有多种氧杂蒽酮衍生物,其具有抗肿瘤、抗氧化等作用,研究表明,山竹果皮提取物可抑制非小细胞肺癌细胞增殖、迁移及侵袭.但山竹果皮中总氧杂蒽酮与胃癌相关研究报道相对较少.微小RNA(miRNA)可通过调控细胞增殖及转移等过程而发挥作用,研究表明,miR-338-3p在胃癌组织中表达下调,并可能参与胃癌发生及发展过程.但miR-338-3p是否可作为山竹果皮中总氧杂蒽酮治疗胃癌的潜在靶点尚未可知.因此,本研究主要探讨山竹果皮中总氧杂蒽酮是否可通过调控miR-338-3p的表达而影响胃癌细胞生物学行为.

1 材料和方法

1.1 材料 山竹果皮粉末(扶风斯诺特生物科技有限公司);人胃癌细胞AGS(宁波明舟生物科技有限公司);Trizol试剂、Lipofectamine™ 3000 Transfection Reagent(美国Invitrogen);反转录与荧光定量PCR试剂(美国Thermo Fisher);miR-NC、miR-338-3p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-338-3p(广州锐博生物);MTT试剂、Transwell小室、Matrigel基质胶(北京索莱宝科技有限公司);兔抗人基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2,MMP2)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9,MMP9)抗体与二抗(美国Abcam);肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)检测试剂盒(上海酶联生物).

1.2 方法

1.2.1 提取山竹果皮中总氧杂蒽酮:称取50 g山竹果皮粉末,加入85%乙醇500 mL,室温孵育24 h,过滤后提取上清液,旋蒸至少量,采用乙酸乙酯萃取,吸取上清液,经过硅胶柱,采用正己烷和乙酸乙酯(5:1)洗脱,液体烘干后得到山竹果皮中总氧杂蒽酮99.6 mg,加入DMSO溶解后置于冰箱内备用,将山竹果皮中总氧杂蒽酮稀释至100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L.

1.2.2 实验分组:AGS细胞加入含有不同浓度(100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L)山竹果皮中总氧杂蒽酮的DMEM培养基培养24 h,分别记为低剂量组、中剂量组、高剂量组.同时将正常培养的AGS细胞记为NC组.采用脂质体转染法将miR-NC、miR-338-3p mimics分别转染至AGS细胞,分别记为miR-NC组、miR-338-3p组.采用脂质体转染法将anti-miR-NC、anti-miR-338-3p分别转染至AGS细胞,转染成功后加入含有浓度为400 μmol/L山竹果皮中总氧杂蒽酮的DMEM培养基培养24 h,分别记为高剂量组+anti-miR-NC组、高剂量组+anti-miR-338-3p组.

1.2.3 MTT检测细胞增殖:收集各组AGS细胞加入MTT溶液20 μL,于培养箱继续培养4 h,弃上清,每孔加入150 μL DMSO,避光振荡孵育5 min,应用酶标仪检测各孔在490 nm处的吸光度值(A).

1.2.4 Transwell实验检测细胞迁移与侵袭:迁移实验:取各组AGS细胞接种于上室,取600 μL含有10%胎牛血清的培养液加入下室,培养24 h,多聚甲醛固定20 min,0.1%结晶紫染液染色15 min,于显微镜下统计迁移细胞数.侵袭实验:小室包被Matrigel基质胶稀释液后固定5 h,后续实验步骤同细胞迁移实验.

1.2.5 ELISA法检测TNF-α、IL-6、IL-1β的水平:收集各组AGS细胞培养上清液,采用ELISA法检测TNF-α、IL-6、IL-1β的水平,严格按照试剂盒说明书进行操作.

1.2.6 qRT-PCR检测miR-338-3p的表达水平:采用Trizol试剂分别提取各组AGS细胞总RNA,应用紫外分光光度计测定RNA浓度.反转录合成cDNA,以cDNA为模板进行qRT-PCR扩增,应用ABI StepOnePlus荧光定量PCR仪检测miR-338-3p相对表达量.

1.2.7 Western blot检测MMP2、MMP9蛋白表达量:提取各组AGS细胞总蛋白,BCA法检测蛋白浓度.取40 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳,转膜后用5%脱脂牛奶封闭2 h,加入1:1000稀释的MMP2、MMP9一抗与内参β-actin抗体(1:2000)稀释液,4 ℃孵育过夜,加入1:3000稀释的二抗稀释液后室温孵育2 h,应用Quantity One软件对蛋白条带进行定量.

采用SPSS 21.0统计学软件分析数据,计量资料以mean±SD表示,两组间比较采用独立样本检验,多组间比较采用单因素方差分析,以＜0.05为差异具有统计学意义.

2 结果

2.1 不同浓度山竹果皮中总氧杂蒽酮对AGS细胞增殖、迁移和侵袭的影响 与NC组比较,低剂量组、中剂量组、高剂量组细胞MMP2、MMP9蛋白水平和细胞活力降低(＜0.05),迁移及侵袭细胞数减少(＜0.05),图1,表1.

图1 不同浓度山竹果皮中总氧杂蒽酮对AGS细胞增殖、迁移和侵袭的影响. A:Western Blot检测MMP2、MMP9蛋白的表达;B:Transwell检测AGS细胞迁移和侵袭;与NC组比较,aP＜0.05;NC:对照组;MMP-2:基质金属蛋白酶-2;MMP-9:基质金属蛋白酶-9;β-actin:β肌动蛋白;aP＜0.05,与对照组比较.

表1 不同浓度山竹果皮中总氧杂蒽酮对AGS细胞增殖、迁移和侵袭的影响(mean±SD,n=9)

2.2 不同浓度山竹果皮中总氧杂蒽酮对AGS细胞炎症反应的影响 与NC组比较,低剂量组、中剂量组、高剂量组TNF-α、IL-6、IL-1β的水平降低(＜0.05),表2.

表2 不同浓度山竹果皮中总氧杂蒽酮对AGS细胞炎症反应的影响(mean±SD,n=9)

2.3 不同浓度山竹果皮中总氧杂蒽酮对miR-338-3p表达的影响 与GES-1细胞比较,AGS细胞中miR-338-3p表达量降低;与NC组比较,低剂量组、中剂量组、高剂量组miR-338-3p的表达量升高(＜0.05),表3,表4.

表3 miR-338-3p在正常胃黏膜上皮细胞GES-1和胃癌AGS细胞中的表达(mean±SD,n=9)

表4 不同浓度山竹果皮中总氧杂蒽酮对miR-338-3p表达的影响(mean±SD,n=9)

2.4 miR-338-3p抑制胃癌细胞细胞AGS增殖、迁移和侵袭以及细胞炎症反应 与miR-NC组比较,miR-338-3p组细胞MMP2、MMP9蛋白水平和细胞活力降低(＜0.05),迁移及侵袭细胞数减少(＜0.05),TNF-α、IL-6、IL-1β的水平降低(＜0.05),图2,表5.

图2 miR-338-3p抑制胃癌细胞细胞AGS迁移和侵袭.A:Western Blot检测MMP2、MMP9蛋白的表达;B:Transwell检测AGS细胞迁移和侵袭;MMP-2:基质金属蛋白酶-2;MMP-9:基质金属蛋白酶-9;β-actin:β肌动蛋白;与miR-NC组比较,aP＜0.05.

表5 miR-338-3p抑制胃癌细胞细胞AGS增殖、迁移和侵袭以及细胞炎症反应(mean±SD,n=9)

2.5 anti-miR-338-3p可以逆转山竹果皮中总氧杂蒽酮对胃癌细胞细胞AGS增殖、迁移、侵袭以及炎症反应的影响 与高剂量组+anti-miR-NC组比较,高剂量组+antimiR-338-3p组细胞MMP2、MMP9水平和细胞活力升高(＜0.05),迁移及侵袭细胞数增多(＜0.05),TNF-α、IL-6、IL-1β的水平升高(＜0.05),图3,表6.

图3 anti-miR-338-3p可以逆转山竹果皮中总氧杂蒽酮对胃癌细胞细胞AGS迁移、侵袭的影响.A:Western Blot检测MMP2、MMP9蛋白的表达;B:Transwell检测AGS细胞迁移和侵袭;MMP-2:基质金属蛋白酶-2;MMP-9:基质金属蛋白酶-9;β-actin:β肌动蛋白;与高剂量组+anti-miR-NC组比较,aP＜0.05.

表6 anti-miR-338-3p可以逆转山竹果皮中总氧杂蒽酮对胃癌细胞细胞AGS增殖、迁移、侵袭以及炎症反应的影响(mean±SD,n=9)

3 讨论

胃癌发病机制较为复杂,分子靶向治疗成为胃癌的潜在治疗方法,目前中医药可通过调控基因或信号通路表达而发挥抗胃癌作用.miRNA在胃癌中表达异常,并可通过靶向调控靶基因表达而参与胃癌发生及发展过程,还可能作为胃癌靶向治疗的潜在靶点.但miRNA是否可作为中医药治疗胃癌的潜在靶点尚未阐明.

山竹果皮中总氧杂蒽酮具有抗肿瘤作用,并可抑制结直肠癌细胞增殖及促进细胞凋亡.本研究结果显示,山竹果皮中总氧杂蒽酮处理后胃癌细胞活力降低,提示山竹果皮中总氧杂蒽酮可抑制胃癌细胞增殖.MMP2、MMP9属于基质金属蛋白酶,其水平升高可降解细胞外基质沉积从而促进细胞转移.本研究结果显示,山竹果皮中总氧杂蒽酮可降低胃癌细胞迁移及侵袭能力,并可抑制MMP2、MMP9表达,提示山竹果皮中总氧杂蒽酮可抑制胃癌细胞迁移及侵袭.慢性炎症与胃癌密切相关,TNF-α、IL-6、IL-1β等炎症因子释放可促进胃癌发展.本研究结果显示,山竹果皮中总氧杂蒽酮处理后胃癌细胞中TNF-α、IL-6、IL-1β的水平降低,提示山竹果皮中总氧杂蒽酮可抑制胃癌细胞炎症反应进而减缓胃癌发展进程.

miR-338-3p通过下调ADAM17而抑制人下咽癌细胞迁移和侵袭.miR-338-3p在胃癌中表达下调,上调其表达可抑制胃癌细胞增殖及转移.miR-338-3p过表达可抑制肺癌细胞增殖及侵袭.本研究结果显示,山竹果皮中总氧杂蒽酮处理后胃癌细胞中miR-338-3p的表达量升高,抑制miR-338-3p表达可拮抗山竹果皮中总氧杂蒽酮对胃癌细胞生物学行为的作用.提示山竹果皮中总氧杂蒽酮可通过促进miR-338-3p表达而抑制胃癌细胞增殖、迁移、侵袭及炎症反应.

4 结论

综上所述,山竹果皮中总氧杂蒽酮可通过上调miR-338-3p表达而抑制胃癌细胞增殖、迁移、侵袭及炎症反应进而减缓胃癌发展进程,miR-338-3p可能作为山竹果皮中总氧杂蒽酮治疗胃癌的潜在靶点.但山竹果皮中总氧杂蒽酮是否可通过调控其他基因而发挥抗胃癌作用尚需进一步探究.

中药及其提取物对胃癌等肿瘤细胞增殖、转移等具有抑制作用,但山竹果皮中总氧杂蒽酮对胃癌细胞生物学行为的影响及其可能作用机制尚未明确.

山竹果皮中总氧杂蒽酮调节胃癌细胞生物学行为的机制尚未可知,已知miR-338-3p可作为胃癌靶向治疗的潜在靶点,但其与山竹果皮中总氧杂蒽酮相关性尚未可知.

山竹果皮中总氧杂蒽酮可通过调控miR-338-3p表达影响胃癌细胞生物学行为.

以人胃癌细胞AGS为研究对象,随机分组:NC组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、miR-NC组、miR-338-3p组、高剂量组+anti-miR-NC组、高剂量组+anti-miR-338-3p组;MTT法、Transwell实验分别检测细胞增殖、迁移及侵袭;ELISA法检测肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)的水平;qRT-PCR法检测miR-338-3p的表达量

山竹果皮中总氧杂蒽酮可抑制胃癌细胞增殖、迁移、侵袭及炎症反应,并可促进miR-338-3p表达,抑制miR-338-3p表达可减弱山竹果皮中总氧杂蒽酮对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭及炎症反应的抑制作用.

山竹果皮中总氧杂蒽酮可通过上调miR-338-3p表达而抑制胃癌细胞增殖、迁移、侵袭及炎症反应.

山竹果皮中总氧杂蒽酮可能用于治疗胃癌,减缓胃癌发展进程.