lncRNA NNT-AS1调控miR-518a-3p抑制IL-17诱导胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的分子机制

0 引言

胃癌是常见的恶性消化系统肿瘤,据统计资料显示,2020年全球范围内病死率高达7.7%,而中国高达2.1%,虽然外科手术、放疗或化疗在治疗胃癌中已经取得了改善,但是胃癌发病机制十分复杂,致使患者5年预后生存期限未超过30%

.白细胞介素17(interleukin 17,IL-17)是多细胞分泌因子,与肿瘤细胞发展有关

,研究显示,胃癌血清中高表达,与患者分化程度、淋巴结转移有关

.lncRNA是一种定义为长度超过200核苷酸的非编码RNA分子的转录本,因为没有完整的开放阅读框,不具备编码蛋白的能力

.lncRNA烟酰胺核苷酸转氢酶-反义RNA1 (NNT-AS1)在癌症中发挥着重要作用,胃癌组织中lncRNA NNT-AS1表达增加,lncRNA NNT-AS1可能通过降低miR-363的表达抑制胃癌细胞增殖和侵袭,并阻滞细胞周期的发展

.然而关于lncRNA NNT-AS1与IL-17调控作用对胃癌细胞研究尚不明确.通过在线生物信息学软件预测显示,miR-518a-3p是NNT-AS1靶基因之一,在三阴性乳腺癌、结直肠癌中miR-518a-3p表达下调,与患者较短生存期有关,miR-518a-3p过表达可抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭

,但是对胃癌的研究尚不清楚.本研究使用IL-17处理胃癌细胞,观察lncRNA NNTAS1靶向调控miR-518a-3p对IL-17诱导的胃癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响.

[9]弗朗西斯·福山：《政治秩序的起源》，毛俊杰译，桂林：广西师范大学出版社，2012年，第431页。

1 材料和方法

1.1 材料 胃癌AGS细胞购于中科院细胞中心;IL-17购于碧云天生物;si-lncRNA NNT-AS1、anti-miR-NC、si-NC、anti-miR-518a-3p、引物购于上海吉玛公司;胎牛血清、DMEM培养基购于美国Hyclone公司;ECL试剂、双荧光素酶活性试剂盒、BCA试剂盒购于北京索莱宝公司;Trizol试剂盒、荧光定量试剂盒、逆转录试剂盒购于大连宝生生物公司;Matrigel基质胶、Transwell小室购于上海泽迈生物公司;神经钙黏蛋白(N-cadherin)抗体、上皮钙黏蛋白(E-cadherin)抗体、细胞核增殖抗原标记物(Ki-67抗体、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP2)抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗体、二抗购于上海赛信通公司;Lipofectamin 2000试剂盒购于美国invitrogen公司.

有这样的一个例子:在美国某法庭上，一位年轻女性被控轻微交通违法，公诉人希望当事人能够接受控辩交易，认罪，但是被告拒绝了。译员告诉辩护律师，女被告拒绝可能是因其本国的司法系统十分腐败，交易意味着被潜规则。于是辩护律师向公诉人解释了这一原因。公诉人向女被告澄清说，这种交换条件是给所有遭受类似指控被告的，没有其他的意图，而且公诉人必须遵守职业守则。于是女被告接受控辩交易，认罪了。

1.2 方法 胃癌细胞AGS用10%胎牛血清的DMEM培养基内,培养箱内进行孵育.取对数期胃癌细胞AGS,细胞分为Con组、IL-17组、IL-17+si-NC组、IL-17+si-lncRNA NNT-AS1组、IL-17+si-lncRNA NNT-AS1+anti-miR-NC组、IL-17+si-lncRNA NNT-AS1+anti-miR-518a-3p组.其中Con组未经进行IL-17处理细胞,IL-17组:使用100 μg/L的IL-17处理细胞;IL-17+si-NC组、IL-17+si-lncRNA NNT-AS1组、IL-17+si-lncRNA NNT-AS1+anti-miR-NC组、IL-17+si-lncRNA NNT-AS1+anti-miR-518a-3p组:将si-NC、si-lncRNA NNT-AS1、si-lncRNA NNT-AS1和antimiR-NC、si-lncRNA NNT-A和S1+anti-miR-518a-3p转染细胞,使用100 μg/L的IL-17处理细胞.按照Lipofectamin 2000试剂盒进行.

2.1 IL-17处理胃癌细胞降低lncRNA NNT-AS1 与Con组比较,IL-17组lncRNA NNT-S1表达水平显著升高(

＜0.05);与IL-17+si-NC组相比,IL-17+si-lncRNA NNTAS1组lncRNA NNT-S1表达水平显著降低(

＜0.05).图1.

1.4 克隆实验检测细胞增殖活性 取对数期胃癌细胞AGS按照1.2法处理细胞,将细胞按照500个/孔接种6孔板中,细胞放到恒温培养箱内培养14 d,有克隆形成时停止培养.使用4%多聚甲醇固定细胞,结晶紫染色,漂洗细胞,待自然晾干后,使用显微镜观察细胞克隆数.

莫扎特于1778年的夏天在巴黎创作了C大调钢琴奏鸣曲K330，这个时期的莫扎特所作的K330与其中在巴黎所创作的作品相比，规模虽然小了一些也更容易弹奏，但是在它的内容方面却是丰富多彩且带有强烈的表现性的，还带有些许的法国风味。

IL-17是多细胞分泌因子,在胃癌血清中高表达,而lncRNA NNT-AS1在胃癌组织中表达增加,lncRNA NNTAS1可能通过降低miR-363的表达抑制胃癌细胞增殖和侵袭,并阻滞细胞周期的发展.lncRNA NNT-AS1与IL-17调控作用对胃癌细胞研究尚不明确.通过在线生物信息学软件预测显示,miR-518a-3p是NNT-AS1靶基因之一,miR-518a-3p在三阴性乳腺癌、结直肠癌中表达下调,本研究观察lncRNA NNT-AS1靶向调控miR-518a-3p对IL-17诱导的胃癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响.

2018年6月，依波钟表文化博物馆建成开馆，该博物馆是深圳首个以时间为主题的钟表博物馆，不仅丰富了当地文化与工业旅游资源，更开启了依波品牌文化建设的新篇章。依波以时间之名，打造国内钟表科普教育基地、工业旅游示范单位、旅游观光景点，全方位展示钟表历史文化、制造流程和工艺智慧。

1.6 蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测Ki-67、E-cadherin、N-cadherin、MMP2蛋白表达 收集培养24 h各组AGS细胞,加放射免疫沉淀法(RIPA)试剂提取细胞总蛋白,BCA法检测蛋白浓度,经过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白样品,结束后转膜,脱脂奶粉封闭1 h,将聚偏二氟乙烯(PVDF)膜放在稀释好的一抗溶液中(Ki-67、E-cadherin、N-cadherin、MMP2,稀释1:600),4 ℃孵育过夜,加稀释浓度为1:3000的二抗溶液,室温孵育1 h,加电化学发光(ECL)试剂显色,曝光.使用Image J软件分析蛋白条带灰度值.

胃癌是常见的恶性消化系统肿瘤,虽然外科手术、放疗或化疗在治疗胃癌中已经取得了改善,但是胃癌发病机制十分复杂,致使患者5年预后生存期限未超过30%.白细胞介素17(interleukin 17,IL-17)是多细胞分泌因子,与肿瘤细胞发展有关,其在胃癌血清中高表达,与患者分化程度、淋巴结转移有关.lncRNA是一种定义为长度超过200核苷酸的非编码RNA分子的转录本,可靶向miRNA影响IL-17诱导的胃癌细胞发展.

实验采用SPSS 19.0软件分析处理数据,结果以(mean±SD)表示,多组间比较用单因素方差分析,两组间比较用

检验.

＜0.05为差异有统计学意义.

2 结果

1.3 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测lncRNA NNTAS1和miR-518a-3p表达水平 取各组AGS细胞培养24 h,Trizol试剂加细胞中提取总RNA,逆转录合成cDNA,配置反应体系:1 μL cDNA、0.5 μL上下游引物、10 μL 2×miRcute miRNA premix,使用RNase-Free ddH2O补充至20 μL.用GAPDH、U6作内参,采用2

法计lncRNA算NNT-AS1和miR-518a-3p表达水平.

2.2 下调lncRNA NNT-AS1对IL-17诱导胃癌细胞增殖的影响 与Con组比较,IL-17组Ki-67蛋白表达、克隆细胞数显著升高(

＜0.05);与IL-17+si-NC组相比,IL-17+silncRNA NNT-AS1组、克隆细胞数Ki-67蛋白表达显著降低(

＜0.05).图2.

2.3 下调lncRNA NNT-AS1对IL-17诱导胃癌细胞迁移和侵袭的影响 与Con组比较,IL-17组迁移细胞数、侵袭细胞数增多(

＜0.05),E-cadherin蛋白表达降低(

＜0.05),N-cadherin、MMP2蛋白表达升高(

＜0.05);与IL-17+si-NC组相比,IL-17+si-lncRNA NNT-AS1组迁移细胞数、侵袭细胞数减少(

＜0.05),N-cadherin、MMP2蛋白表达降低(

＜0.05),E-cadherin蛋白表达升高(

＜0.05).图3.

2.4 lncRNA NNT-AS1调控miR-518a-3p的表达 在线生物信息学网站预测显示,lncRNA NNT-AS1和miR-518a-3p存在相互结合位点,见图3.与miR-NC组相比,miR-518a-3p组lncRNA NNT-AS1 MUT荧光素酶活性差异不显著,lncRNA NNT-AS1 WT荧光素酶活性显著降低(

＜0.05).图4.

1.3 生态类型复杂多样 由于消落带水位周期性消涨，库岸不同高程的消落程度不同，加上土壤基质、坡度、湿度等方面的差异以及人类频繁活动的干扰，消落区域物种关系和生态类型复杂多样。

2.5 下调lncRNA NNT-AS1对IL-17诱导胃癌细胞后miR-518a-3p表达 与Con组比较,IL-17组miR-518a-3p表达水平显著降低(

＜0.05);与IL-17+si-NC组相比,IL-17+si-lncRNA NNT-AS1组miR-518a-3p表达水平显著增加(

＜0.05).图5.

3 讨论

IL-17是Th17细胞分泌的炎性因子,在肿瘤组织中表达上调,与肿瘤微环境中血管形成有关系

.研究结果证明

,IL-17与胃癌发展密切相关,研究显示,IL-17对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用.本研究结果显示,IL-17处理胃癌细胞AGS,克隆细胞数、迁移细胞数、侵袭细胞数增多,下调E-cadherin蛋白表达,上调Ki-67、N-cadherin、MMP2蛋白表达,提示IL-17能诱导胃癌细胞增殖、侵袭和侵袭,这与之前的研究结果

一致.

lncRNA是多功能非编码调控转录本,lncRNA NNTAS1是一种新发现的促癌非编码RNA分子,既往的研究结果显示,在乳腺癌、卵巢癌、胶质瘤等癌症中异常表达,与患者总生存期、TNM分期等有关

.前列腺癌研究结果显示,lncRNA NNT-AS1表达水平在前列腺癌细胞中表达增加,沉默lncRNA NNT-AS1能够抑制前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭,并诱导细胞凋亡

.在胃癌组织和细胞中lncRNA NNT-AS1表达增加,与患者较差的预后有关,lncRNA NNT-AS1通过降低miR-424抑制胃癌细胞增殖和侵袭,阻滞细胞周期发展

.胃癌细胞中,lncRNA NNT-AS1还能够通过调控miR-142-5p/性别决定基因-区域转录因子4(SOX4)轴抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭,并促进细胞凋亡

.以上说明lncRNA NNTAS1与肿瘤发展相关,且在胃癌中起促癌作用,但是关于lncRNA NNT-AS1与IL-17的调控作用不清楚.本研究结果显示,IL-17处理胃癌细胞后lncRNA NNT-AS1表达增加,下调lncRNA NNT-AS1降低了IL-17诱导胃癌细胞中lncRNA NNT-AS1表达水平,提示lncRNA NNT-AS1可能与IL-17诱导胃癌细胞有关.下调lncRNA NNT-AS1减少IL-17诱导胃癌细胞克隆细胞数、迁移细胞数、侵袭细胞数,增加E-cadherin蛋白表达,降低Ki-67、N-cadherin、MMP2相关蛋白表达,提示下调lncRNA NNT-AS1抑制IL-17诱导的胃癌细胞增殖、迁移和侵袭.

lncRNA还能够作为竞争性内源RNA调控miRNA表达参与肿瘤的发展

,在本研究中,通过双荧光素酶报告实验和RT-qPCR实验验证lncRNA NNT-AS1靶向调控miR-518a-3p的表达.miR-518a-3p在癌症中低表达,如在非小细胞肺癌细胞中表达降低,LINC00461可充当miR-518a-3p海绵抑制非小细胞肺癌细胞增殖和转移

.在口腔鳞癌细胞中miR-518a-3p表达降低,功能实验显示,lncRNA HOXA11-AS可能通过降低miR-518a-3p抑制口腔鳞癌细胞增殖、侵袭,并阻碍细胞周期发展

.本研究发现,IL-17处理胃癌细胞后降低miR-518a-3p表达,下调lncRNA NNT-AS1增加IL-17处理胃癌细胞后miR-518a-3p,说明lncRNA NNT-AS1靶向负调控miR-518a-3p.进一步实验结果显示,抑制miR-518a-3p可以逆转下调lncRNA NNT-AS1对IL-17诱导胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用,提示lncRNA NNT-AS1靶向负调控miR-518a-3p影响IL-17诱导的胃癌细胞增殖、迁移、侵袭.

4 结论

综上所述,下调lncRNA NNT-AS1能抑制IL-17诱导的胃癌细胞增殖、迁移和侵袭,可能与上调miR-518a-3p有关,旨在为胃癌诊断提供新的作用靶点.本研究也存在不足之处,关于lncRNA NNT-AS1体内实验需要我们进行后续实验研究.

财务会计其主要工作内容就是以会计准则为根据，对企业资金进行监管、核算、证实以及统计，进而为与自身企业存在联系的个体以及群体提供相应的数据信息。企业资金状况通过财务会计的核算与监管，可以为企业领导人提供相应的资金数据信息，从而让相关管理人员以及领导高层认识到企业自身的资金运转情况以及经济效益，进而对企业自身实际运转情况进行深度了解。为制定相应的解决措施提供支撑，从而为企业健康可持续发展奠定良好的基础。

2.6 抑制miR-518a-3p可以逆转下调lncRNA NNT-AS1对IL-17诱导胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响 与IL-17+si-lncRNA NNT-AS1+anti-miR-NC组相比,IL-17+silncRNA NNT-AS1+anti-miR-518a-3p组克隆细胞数、迁移细胞数、侵袭细胞数增多(

＜0.05),Ki-67、N-cadherin、MMP2蛋白表达升高,E-cadherin蛋白表达降低(

＜0.05).图6.并根据以上结果,绘制了lncRNA NNT-AS1在胃癌细胞中分子机制图,图7.

1.7 双荧光素酶实验检测miR-518a-3p和lncRNA NNTAS1关系 构建miR-518a-3p相互结合位点lncRNA NNTAS1的荧光素酶载体,将突变型、野生型报告载体(lncRNA NNT-AS1 MUT、lncRNA NNT-AS1 WT)分别与miR-NC或miR-518a-3p转染至胃癌细胞AGS中,转染按照脂质体法,转染48 h,根据双荧光素酶活性检测试剂盒操作进行,SpectraMax Mini多功能酶标仪(美谷分子仪器有限公司)检测各组荧光素酶活性.其中萤火虫荧光素酶活性值为内参,计算各组荧光素酶活性.

大极虎的目光落在站在萧飞羽身后的只手拿云身上冷冷地道：“我就奇怪晌午怎会有人持黑旗令传喻本镇居民。”只手拿云错愕，因为他知道此事，但与黑旗会所属同赴安和庄还没时间弄明白这事原由，不过他也很快恍然大悟全镇居民关门闭户是源于安和庄。他道：“我与传喻之事无关，也不知是怎么回事。这位是三少，也是安和庄的主人。”看到只手拿云脸上的歉意，太极虎脸色骤沉。“你该是与安和庄暗通款曲坑了去安和庄的本坛所属。”

1.5 Transwell检测细胞迁移、侵袭 迁移实验:各组AGS细胞培养48 h,用不含血清培养基重悬细胞(2×10

个/mL),Transwell上室添加细胞悬液200 μL,下室加500 μL含血清培养基,培养24 h,取出小室使用棉签擦掉未穿膜的细胞,用多聚甲醛固定细胞,再用结晶紫染色,显微镜观察细胞迁移数.侵袭实验:将50 μL的Matrigel基质胶稀释液铺至Transwell上室内,凝固5 h,后续实验同迁移实验一致.

验证lncRNA NNT-AS1靶向调控miR-518a-3p对IL-17处理胃癌细胞增殖、迁移、侵袭的作用.

EM断路器通常与电能表安装在同一表箱内，可通过电能表发出的开关控制信号控制其分、合闸，相对于传统微型空气开关，它不仅有简单的过流保护功能，还增加了欠费分闸、分合闸状态反馈等费控辅助功能。它的主要结构包括外壳、操作机构、动静触头、脱扣器等，某型号单相电能表用外置断路器如图1所示。

RT-qPCR检测miR-518a-3p和lncRNA NNT-AS1表达水平;克隆实验、Transwell检测AGS细胞增殖、迁移、侵袭;Western Blot检测增殖、转移蛋白表达;双荧光素酶实验检测miR-518a-3p和lncRNA NNT-AS1关系.

跨境电商师资培训应还当充分利用社会资源，与跨境电商企业合作，创建开放性的培训模式解决凭借培训单位一己之力难以解决的培训师资短缺问题。在开放性的培训模式下，培训课程的讲师不应受限于教师资格和学历，企业专门技术人才和部门主管等社会人员都可以聘请来对受训教师进行实践技能培训。此外，在开放性培训模式下，培训单位和基地不仅仅可以在校内建设跨境电商培训中心用于教师培训，还可以与企业合作，直接将受训教师派驻企业进行顶岗实习，使其获得最直观的工作感受从而达到最佳的培训效果。

IL-17能诱导胃癌细胞增殖、侵袭和侵袭;下调lncRNA NNT-AS1抑制IL-17诱导的胃癌细胞增殖、迁移和侵袭;lncRNA NNT-AS1靶向负调控miR-518a-3p.进一步实验结果显示,抑制miR-518a-3p可以逆转下调lncRNA NNTAS1对IL-17诱导胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用.

lncRNA NNT-AS1靶向调控miR-518a-3p抑制IL-17诱导胃癌细胞增殖、迁移和侵袭.

旨在为胃癌诊断提供新的作用靶点.

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