cid-miR-146a在LCDV-cn感染中的差异表达及其调控作用

胡海浩，黄鉴涛，马嘉霖，杨 硕，闫秀英，简纪常

（广东海洋大学水产学院/广东省水产动物病害防控与健康养殖重点实验室/水产经济动物病害控制广东普通高校重点实验室，广东 湛江 524088）

鱼淋巴囊肿病毒中国株（Lymphocystis disease virus China,LCDV-cn）是牙鲆（Paralichthys olivaceus）淋巴囊肿病的病原[1]，致使患鱼在皮肤、鳍、尾部等长有囊肿，给牙鲆养殖造成了重大损失。对LCDVcn 及牙鲆淋巴囊肿病的研究已取得一定进展[2-6]，但牙鲆淋巴囊肿病的有效防控依然是水产养殖业中的难题，其原因之一是LCDV-cn 的致病机制知之甚少[7]。微小RNA（miRNA）可通过与靶基因结合对靶基因的转录进行调控，从而参与多种病理、生理过程[8]。因此，对LCDV-cn 感染过程中miRNA 的调控作用进行研究，可在miRNA 层面解析LCDV-cn的致病机制。

研究发现不同物种miR-146a的序列高度保守，提示miR-146a在生物体的生理、病理过程中可能发挥重要作用[8]。已有研究表明miR-146a在多种肿瘤中高度表达，调控肿瘤发生发展的许多生物学过程，而且miR-146a 的调控具有促肿瘤发展的作用，抑制miR-146a 的表达可使肿瘤细胞的致瘤性和侵袭力下降[9-10]。更有研究表明miR-146a 调控病毒的感染过程，如在乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染过程中，miR-146a 通过抑制机体抗病毒反应促进HBV 复制和蛋白表达[11]；丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus,HCV）感染可诱导miR-146a 的表达上调，从而促进病毒感染[12]；在人乳头瘤病毒（Human papilloma virus，HPV）感染中，miR-146a 发挥多重作用，调控HPV 的感染进展[13]；还有研究发现，miR-146a 的上调与EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染引起的肿瘤细胞增殖相关[14-15]、有些病人miR-146a 的下调可能与新型冠状病毒（Corona covid-19 virus，COVID-19）感染引起的严重症状有关[16]、miR-146a 可调控人类免疫缺陷病毒（Human immunodefdiciency virus type 1,HIV-1）感染[17]、miR-146a 的表达上调可促进石斑鱼虹彩病毒（Singapore grouper iridovirus，SGIV）感染[18]，等。上述研究表明miR-146a 在病毒感染和肿瘤发生中起着重要的调控作用。

本课题组前期研究[19]表明，草鱼miR-146a（Ctenopharyngodon idellamiR-146a，cid-miR-146a）在LCDV-cn 感染草鱼卵巢细胞系（grass carp ovary cells，GCO）过程中存在显著差异表达。因此，本研究在LCDV-cn感染GCO 过程中，对cid-miR-146a进行鉴定和表达特性分析，并探索cid-miR-146a 的调控作用，为在miRNA 层面解析LCDV-cn 的致病机制等提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

LCDV-cn 分离自患淋巴囊肿病的牙鲆，保存于本实验室；GCO细胞购买于深圳检验检疫局。

本研究所用引物见表1，在上海生工生物技术有限公司合成。

1.2 LCDV-cn感染GCO细胞

用25 cm2细胞培养瓶于28 ℃培养GCO 细胞，具体操作参照文献[2,19]，所用培养基为MEM 培养基[含体积分数10%胎牛血清（FBS）]，正常传代约48 h 单层细胞铺满瓶底时，吸出培养液，取1 mL 的LCDV-cn 悬液（滴度浓度105.5TCID50/mL[19]）进行感染（同时设未感染组为对照组），于20 ℃下孵育1 h后，取出病毒悬液，加入4 mL 维持液（含体积分数2%FBS 的MEM 培养基）于20 ℃下继续感染实验，并定时取样。

1.3 电镜负染

取10 mL 滴度浓度（105.5TCID50/mL）的LCDV-cn悬液[19]，于室温和-80 ℃反复冻融4 次，于4 ℃、1 000g条件下离心30 min，取上清用质量分数3%磷钨酸进行染色，于广东医科大学附属医院进行电镜观察。

1.4 颈环（Stem-loop）RT-PCR

取LCDV-cn感染GCO 72 h时样品1瓶（细胞培养瓶），胰酶消化后取1×106个细胞，于室温、1 000g条件下离心3 min，弃上清后，加入1 mL Trizol，按照TRIzol™LS试剂盒说明书提取RNA，并用10 mg/mL琼脂糖凝胶电泳检测RNA 完整性。用提取的RNA和颈环反转录引物RT-cid-miR-146a（表1），按照反转录试剂盒PrimeScript™RTreagent Kit with gDNA Eraser 说明书进行特异性反转录，制备颈环RT-PCR模板cDNA，保存于-80 ℃备用。

表1 引物序列Table 1 Primers used in this study

根据前期研究结果[19]，采用颈环RT-PCR 扩增cid-miR-146a，所用引物cid-miR-146a-F 和cid-miR-146a-R 见表1。PCR 扩增体系为50 μL，包含EX-Taq 25 μL、cDNA 3 μL（质量浓度约为50 μg/mL）、cid-miR-146a-F 2 μL、cid-miR-146a-R 2 μL 和ddH2O 18 μL。PCR 反应条件为95 ℃变性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸60 s，循环40 次。然后用3%（质量体积比）琼脂糖凝胶电泳进行检测。颈环RT-PCR 扩增获得目的片段的长度为60 bp，包括上游序列4 bp（5′-GCGC-3′）、cid-miR-146a序列23 bp（5′-TGAGA ACTGAATTCCATAGATGG-3′）、颈环序列33 bp（5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATC GAC-3′）。将cid-miR-146a 插入至pMD18-T 载体，然后转化至DH5α，于37 ℃下进行培养。按蓝白斑筛选方法选取阳性菌落[1]，并将阳性菌落送往上海生工生物技术有限公司进行测序。

1.5 定量PCR

收集LCDV-cn 感染GCO 细胞后0、4、8、16、24、48、72、144 和196 h 样品，然后制备cDNA（同前）用于定量PCR。所用引物cid-miR-146a-F、cid-miR-146a-R、U6F和U6R见表1，定量PCR总体积为10 μL，包含TB Green Premix Ex Taq II 5 μL、cDNA 1 μL、cid-miR-146a-F 1 μL、cid-miR-146a-R 1 μL 和ddH2O 2 μL。反应条件为95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s、60 ℃退火30 s，循环40次。

上调下调实验中，cid-miRNA-146a 在GCO 细胞的表达定量。上调下调实验包括4 组：上调组（转染cid-miR-146a mimics 模拟物，转染浓度为20 nnmol/L）、下调组（转染cid-miR-146a inhibitor 抑制物，转染浓度为20 nnmol/L）、阴性对照（NC组：转染NC，转染浓度为20 nnmol/L，）和阳性对照（LCDV-cn 正常感染组，无转染）。cid-miR-146a mimics、cid-miR-146a inhibitor 和NC的序列分别为5′-UGAGAACUGAAUUCCAUAGAUGG-3′、5′-CCAUCUAUGGAAUUCAGUUCUCA-3′和5′-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3′，于上海生工生物技术有限公司合成。用不含抗生素的MEM（含体积分数10%FBS）培养GCO细胞，当GCO细胞于12～16 h 单层生长至70%～90%时，使用Lipo‐fectamineTMRNAiMAX 将cid-miR-146a mimics、cidmiR-146a inhibitor 和NC 分别转染至GCO 细胞，培养24 h后，用LCDV-cn进行感染，于20 ℃继续培养。然后，收集LCDV-cn 感染GCO 细胞0、4、8、16、24、48、72、144 和196 h 样品，制备cDNA 用于cid-miR‐NA-146a 的定量。定量PCR 所用引物、定量PCR 体系和反应条件同上述cid-miRNA-146a的表达定量。

cid-miRNA-146a 靶基因Flt1的表达定量。样品制备同上述上调下调实验。定量PCR 所用引物RT-Flt-F、RT-Flt-R、18s-F 和18s-R 见表1，定量PCR体系和反应条件同上述cid-miRNA-146a 的表达定量。

根区温度对嫁接黄瓜苗叶绿素荧光参数的影响…………………………… 刘念奇，宋 阳，孙世君，高 宇，吴佳旺，崔晓晗（118）

LCDV-cnmcp（主要衣壳蛋白，major capsid protein）的表达定量（代表LCDV-cn 的复制[7]）。样品制备同上述上调下调实验。定量PCR 所用引物RT-LCDV-MCP-F、RT-LCDV-MCP-R、18s-F 和18s-R见表1，定量PCR 体系和反应条件同上述cid-miR-146a的表达定量。

1.6 统计分析

应用SPSS 24 软件，用2-ΔΔCt法[23]进行单因素方差分析，并统计差异显著与否（P<0.05或P<0.01）。

1.7 cid-miR-146a靶基因预测

应用RNAhybrid（https://bibiserv.cebitec.unibielefeld.de/rnahybrid/）、miRanda（http://www.microrna.org/）和TargetScan（http://www.targetscan.org/fish_62/）软件预测cid-miR-146a的靶基因。3 个软件预测到的共同靶基因作为靶向目标进行后续研究。

1.8 双荧光素酶系统验证cid-miR-146a的靶基因

应用RNA22 预测cid-miR-146a 靶基因的靶位点，根据靶位点设计扩增靶基因片段的引物为pmirGLO-Flt1-F和pmirGLO-Flt1-R（表1）。RT-PCR总体积为50 μL，包含ExTaq™酶25 μL、pmirGLOFlt1-F 2 μL、pmirGLO-Flt1-R 2 μL、cDNA 3 μL、ddH2O 18 μL。PCR 反应条件为95 ℃3 min；95 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃1 min，35 个循环；最后72 ℃延伸5 min。将PCR 产物与pMD18-T 载体连接，进行亚克隆。通过菌落PCR（引物见表1）和测序进行验证。将验证正确的靶基因片段插入至双荧光素酶启动子pmirGLO 载体上，构建pmirGLO-Flt1 载体，并进行亚克隆。通过菌落PCR和测序进行验证。将正确构建的pmirGLO-Flt1载体分别与cid-miR-146a mimics、cid-miR-146a inhibitor 和NC 共转染至GCO细胞，于20 ℃培养48 h，检测各组细胞荧光素酶活性。

1.9 生物信息学方法预测cid-miR-146a调控LCDV-cn感染的信号通路

应 用GO（http://geneontology.org/）和KEGG（https://www.genome.jp/kegg/）数据库对cid-miR-146a可能参与的信号通路进行富集分析。

2 结果与分析

2.1 LCDV-cn感染GCO细胞的过程

LCDV-cn感染GCO细胞后，呈现的细胞病变效应（cytopathic effect,CPE）与文献[2]一致。LCDVcn 感染GCO 细胞后3 d，细胞聚集、呈现明显的“疤痕”现象，“疤痕”一直持续到约感染后6 d，6 d 之后细胞逐渐脱落、裂解，出现空洞（图1）。

图1 LCDV-cn感染GCO细胞Fig.1 GCO cells challenged with LCDV-cn

2.2 感染用LCDV-cn悬液电镜负染

LCDV-cn 以滴度浓度105.5TCID50/mL[19]进行后续感染实验，感染用病毒悬液进行电镜负染可看到病毒粒子（直径约110 nm）（图2）。

图2 感染用LCDV-cn悬液电镜负染Fig.2 Electron microscope of negative staining with LCDV-cn suspension for infection

2.3 cid-miR-146a的扩增

电泳结果表明28S、18S和5S rRNA条带完整清晰(图3)，说明提取的样品总RNA 无降解，可用于后续实验。颈环RT-PCR 扩增后，电泳检测表明获得目的片段（图4(a)）。经菌落PCR（图4(b)）和测序验证获得的片段是正确的，即为cid-miR-146a。cidmiR-146a 的序列为5′-UGAGAACUGAAUUCCAU‐AGAUGG-3′（23 bp），经序列比对发现，cidmiR-146a与其他物种miR-146a同源（表2）。

表2 已知的miR-146a序列Table 2 Known miR-146a sequences

图3 提取的样品总RNAFig.3 Extracted total RNA of samples

图4 cid-miR-146a颈环RT-PCR和菌落PCRFig.4 Stem-loop RT-PCR and colony PCR of cid-miR-146a

2.4 cid-miR-146a 在LCDV-cn 感染GCO中的表达特性

依据LCDV-cn 感染GCO 细胞出现CPE 现象的变化特点，选取LCDV-cn 感染后0、4、8、16、24、48、72、144和196 h样品，进行差异表达分析。由图5可知，从0 到72 h，cid-miR-146a 的表达量逐渐增加，144和196 h时cid-miR-146a的表达量下降。

图5 cid-miR-146a在LCDV-cn感染GCO过程中的表达Fig.5 Expression of cid-miR-146a in GCO cells infected with LCDV-cn

2.5 cid-miR-146a靶基因的预测

RNAhybrid 预测到cid-miR-146a 的靶基因为Gimap8（GTP 酶免疫相关蛋白8，GTPase immuneassociated protein 8）、LEPR（瘦素受体，leptin receptor）、Flt1（Fms 相关酪氨酸激酶1，Fms-related tyrosine kinase 1）和DLGAP5（Discs 大同源相关蛋白5，Discs large homologous affinity protein 5），其总评分值分别为-0.41、-0.01、-0.32和-0.046（评分值为负数，靶基因的概率大）。miRanda 预测到cid-miR-146a 的靶基因为PDIA3（蛋白质二硫键异构酶A3,protein disulfide-isomerase A3）、irak1（细胞介素-1受体相关激酶-2）、LOX（赖氨酰氧化酶，lysyl oxidase）和Flt1（Fms 相关酪氨酸激酶1，Fms-related tyrosine kinase 1），其总评分值分别为-0.013、-0.046、-0.19和-0.31。TargetScan 预测到cid-miR-146a 的靶基因为DIO-1（碘代甲状腺氨酸脱碘酶1，iodothyronine deiodinase 1）、Flt1（Fms 相关酪氨酸激酶1，Fmsrelated tyrosine kinase 1）和Gimap8（GTP酶免疫相关蛋白8，GTPase immune-associated protein 8），其总评分值分别为-0.18、-0.32和-0.41。预测到的靶基因与癌症和肿瘤发生、抗原呈递和感染反应相关。

此3 个软件均预测到Flt1是cid-miR-146a 的靶基因，因此后续以Flt1为靶标开展实验。应用RNA22 预测到Flt1含有 结合cid-miRNA-146a 的位点（折叠能为-72.38 kJ/mol，P值为0.353），Flt1与cid-miRNA-146a 结 合 的 位 点 序 列 为：5′-UACA‐AAAGGGAGGUUCAGUUCUC-3′（图6），位于Flt1mRNA（GenBank 编码：XM_039667029）的280-302碱基（图6）。

图6 cid-miR-146a靶向Flt1基因的结合位点Fig.6 Binding sites of the gene Flt1 targeted with cid-miR-146a

2.6 cid-miR-146a的靶基因Flt1验证

选取含靶位点的Flt1片段，其长度为456 bp，位于Flt1mRNA 的249-704 碱基。经RT-PCR 扩增后将目的Flt1片段插入至pmirGLO 载体，菌落PCR、XhoⅠ和SalⅠ双酶切（图7）和测序结果说明目的片段是正确的，成功构建pmirGLO-Flt1，并应用双光素酶报告基因系统验证靶基因。双荧光素酶报告系统检测双荧光素酶的活性结果显示（图8）：共转染cid-miR-146a mimics 和pmirGLO-Flt1 后，双荧光素酶活性显著下降，并与其它两组（共转染cid-miR-146a inhibitor 或NC）差异显著（P<0.05），表明Flt1确实是cid-miR-146a的靶基因。

图7 pmirGLO-Flt1双酶切Fig.7 Double enzyme digestion of pmirGLO-Flt1

图8 双荧光素酶活性检测Fig.8 Detection of luciferase activity

2.7 cid-miR-146a在上调下调GCO细胞中的表达量

对cid-miR-146a 进行上调下调后，定量PCR 结果表明（图9）：在cid-miR-146a 上调和下调的GCO细胞中，cid-miR-146a 的表达量与阳性对照组和阴性对照组中的表达量存在显著差异（P<0.05）；cidmiR-146a 上调组中，cid-miR-146a 的表达量明显升高（P<0.05），而在cid-miR-146a 下调组中，cid-miR-146a 的表达量明显下降（P<0.05）。由此也说明转染cid-miR-146a mimics 和cid-miR-146a inhibitor 的浓度20 nnmol/L 是合适的，后续研究按此浓度20 nnmol/L进行。

图9 上调下调实验中cid-miRNA-146a在GCO细胞的表达Fig.9 Expression of cid-miRNA-146a in GCO cells for the up-down regulation experiment

2.8 cid-miR-146a对其靶基因Flt1的调控

对cid-miR-146a 进行上调下调后，靶基因Flt1定量PCR 结果表明（图10）：在cid-miR-146a 上调组，Flt1的表达量最少，与其它组的表达量存在显著差异（P<0.05）；在cid-miR-146a下调组，Flt1的表达量最多，与其它组的表达量存在显著差异（P<0.05）；在阳性对照组，Flt1的表达量先下降然后上升，在72和144 h时最少。

图10 GCO细胞中Flt1的表达Fig.10 Expression of the gene Flt1 in GCO cells

2.9 cid-miRNA-146a对LCDV-cn复制的调控

对cid-miR-146a 进行上调下调后，LCDV-cnmcp基因定量PCR 结果（mcp的表达代表LCDV-cn的复制）表明（图11）：在cid-miR-146a 上调组，mcp基因的表达量最多，峰值在72 h，与其它组的表达量差异显著（P<0.05）；在cid-miR-146a下调组，mcp基因的表达量最少，与其它组的表达量差异显著（P<0.05）；在阳性对照组（LCDV-cn 正常感染），mcp基因的表达量先上升后下降，与上调组趋势一致，峰值在72 h。由此说明，cid-miR-146a 上调促进LCDV-cn 在GCO 细胞的复制，cid-miR-146a 下调后LCDV-cn在GCO细胞的复制降低。

图11 GCO细胞中mcp基因的表达Fig.11 Expression of the mcp gene in GCO cells

2.10 生物信息学预测cid-miR-146a 在LCDV-cn 感染过程中调控的信号通路

应用GO 和KEGG 预测到cid-miR-146a 调控的信号通路可能包括Toll样受体（Toll-like receptor）信号通路（P值为0.005 6）、NF-кB（nuclear factor κB）信号通路（P值为0.009 4）和ErbB（receptor tyrosine kinases）信号通路（P值为0.0266 7）等。Toll 样受体可识别病原体、快速激活先天免疫，NF-кB可调节涉及免疫、细胞存活等的基因，ErbB 可调控细胞增殖、分化和存活等（https://www.genome.jp/kegg/）。

3 讨论

miRNA 在病毒感染和肿瘤发生中起着重要的调控作用，miR-146a 作为不同生物中比较保守的miRNA，已成为抗病毒感染和抗肿瘤等研究的热点[9-18]。高通量测序表明在LCDV-cn感染GCO 过程中，cid-miR-146a 的表达存在显著差异[19]，本研究以cid-miR-146a 为目标miRNA，探索cid-miR-146a 对其靶基因和LCDV-cn复制的调控作用。

LCDV-cn 感染GCO 后的CPE 现象呈现出“疤痕”和空洞，与Zhang等[2]的研究一致。在本研究中，LCDV-cn 感染GCO 后CPE 现象的变化与cid-miR-146a的表达变化时间点呈正相关：在LCDV-cn 感染GCO 后，细胞聚集“疤痕”形成的过程（图2），cidmiR-146a 的表达一直上调（图4）；细胞脱落、裂解、“疤痕”消失的过程（图2），cid-miR-146a的表达下调（图4）。总之，在LCDV-cn 感染GCO 细胞过程中，cid-miR-146a的表达先上升（3 d前）后下降（6 d后）。在病毒感染的不同时期，cid-miR-146a 呈先上调后下调的表达模式，这在其它病毒感染中也得以发现，如，在HPV感染中，在感染的起始阶段miR-146a表达上调，在感染后期miR-146a表达下调[13]。

本研究表明cid-miR-146a靶向Fms相关酪氨酸激酶1 (FLT1)的编码区而发挥其调控作用。FLT1是血管内皮生长因子（VEGF）受体之一，Flt1广泛表达于肿瘤细胞，与血管生成和肿瘤发生相关[24]。在本研究中，LCDV-cn 感染后引起的淋巴囊肿病是一种皮肤瘤（可自愈），在较大的囊肿上有肉眼可见的红色血管[25]，说明在LCDV-cn 引起的皮肤瘤发展过程中确实存在着血管生成。研究表明在多种肿瘤中Flt1的表达异常，如，在神经胶质瘤中Flt1的表达高度上调[24]、在头颈鳞状上皮细胞癌中Flt1选择性上调表达[26]等。本研究发现在LCDV-cn 感染GCO细胞过程中，cid-miR-146a 对其靶基因Flt1的表达起着负调控作用（图10），与HPV 感染中miR-146a的调控相似。在HPV 感染引起的肿瘤中，miR-146a靶向调控表皮生长因子受体（EGFR），且miR-146a负调控EGFR的表达[27]。在其它一些肿瘤研究中，也发现了miRNA 对Flt1的负调控作用，如，miR-139-5p 靶向Flt1抑制Flt1的表达，从而调控人类神经胶质瘤的发展[24]。此外，研究发现降低或抑制Flt1的表达可控制肿瘤的发展等：乳腺癌中Flt1的抑制可以降低肿瘤转移效率[28]，敲降Flt1的表达可以阻止胶质瘤细胞的传播[29]，在绒膜癌细胞中Flt1基因是特定类型细胞肿瘤的抑制剂[30]。而且，血管生成对肿瘤发展来说是必不可少的，FLT1是血管生成和肿瘤发生的主要调控因子之一[24,31]，因此，Flt1已成为一种新型潜在的肿瘤治疗靶点[28-29]。虽然本研究表明cid-miR-146a对Flt1的表达起着负调控作用，但其对LCDV-cn感染的调控机制有待深入研究。

本研究结果进一步表明LCDV-cn的复制与cidmiR-146a 的表达呈正相关（图11），随着cid-miR-146a 的上调下调而变化。在其它病毒感染中，也发现miR-146a的表达与病毒复制呈正相关，并促进病毒复制。如，miR-146a 促进HBV 的复制，可提高HBV 引起肝癌的风险[32-33]。此外，目前研究表明在病毒感染中，miR-146a 调控免疫相关等信号通路，从而调控病毒的复制。如，在流感病毒H1N1 和H3N2 感染中，miR-146a 参与的信号通路包括Toll样受体信号通路、先天免疫反应、细胞因子的产生和凋亡[34]；在EBV 感染过程中，miR-146a 参与淋巴细胞信号通路和干扰素信号通路等[35]。本研究应用生物信息学方法预测到cid-miR-146a可能参与调控Toll 样受体信号转导通路、NF-кB 信号通路和ErbB信号通路，这些信号通路与免疫和肿瘤发生相关。因此，推测cid-miR-146a 调控的LCDV-cn 致病机制可能涉及与宿主免疫因子的互作、肿瘤发生发展等，cid-miR-146a 对LCDV-cn 感染的调控机制还有待深入研究。本研究还发现Flt1的表达与LCDVcn 的复制呈负相关，但Flt1对LCDV-cn 复制的调控机制有待解析。