海龙黄精散对微波辐射诱导少弱精子症小鼠受损生精细胞的作用研究

陈天帷，李志刚，王 彬，毕焕洲，李海松，于珊珊，叶雯佳

(1.北京中医药大学第一临床医学院，北京 100700；2.北京中医药大学针灸推拿学院，北京 100029；3.北京中医药大学东直门医院，北京 100700；4.北京中医药大学深圳医院，广东 深圳 518172)

不育症是指育龄男女同居1年未避孕，有正常性生活而未孕[1]。少弱精子症是造成男性不育或生育力下降的主要原因之一[2-3]。长期电磁辐射环境的暴露被认为是精子质量下降的原因之一[4]。现代医学针对少弱精子症尚无特效药，治疗药物主要以他莫昔芬、氯米芬、胰激肽原酶、左卡尼汀、维生素E为主[5]。毕焕洲等[6]通过长期临床实践发现，海龙、黄精两味中药按照1∶1比例组成海龙黄精散，治疗微波辐射引起的男性不育症有显著疗效。研究表明，炎症反应可上调精浆白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等炎性因子水平，且与精子数量减少、进行性精子活动能力下降有关[7]。本实验以微波辐射诱导少弱精子小鼠为模型，以TNF-α、IL-6、白介素-12(IL-12)为观察指标，探讨海龙黄精散干预少弱精子症的作用机制，为海龙黄精散治疗少弱精子症提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物与分组：选用SPF级7周龄BALB/c雄性小鼠40只，动物购自广东省医学实验动物中心，许可证号SCXK(粤)2018-002。将小鼠饲养于深圳市耳鼻咽喉研究所实验室，室温(24±1)℃，湿度(50±5)%，12 h明暗交替，适应性喂养1周。遵循《关于善待实验动物的指导性意见》[8]进行实验操作。

1.1.2 实验药物：海龙、黄精由北京中医药大学深圳医院中药房提供。

1.1.3 实验仪器与试剂：微波治疗仪(KJ-6200B型，徐州市万诺医疗设备有限公司)，微波泄露检测仪(HI-1501型，美国ETSLindgren公司)，生物倒置显微镜(BX43型，日本Olympus公司)，数字病理切片扫描仪(VS200型，日本Olympus)，多功能酶标仪(SpectraMax M3型，美国Molecular Devices公司)。TNF-α ELISA kit(批号 KGEMC102a，凯基生物)，IL-1 ELISA kit(批号 EK1176)，IL-6 ELISA kit(批号 EK1222)，IL-12 ELISA kit(批号 EK14746)。

1.2 实验方法

1.2.1 建模、分组与给药：将40只小鼠采用随机数字表法进行分组，分为空白组、模型组及海龙黄精散小、中、大剂量组，每组8只，除空白组外，其余四组进行微波辐射造模。参照文献[9]建立微波辐射不育症模型，将小鼠置于透明亚克力缸中，暴露在频率为2450 MHz连续微波，功率密度为40 mW/cm2，辐射18 d，每天1 h。模型组：造模同时灌胃0.9%氯化钠溶液0.1 ml。空白组：置于微波灯下但未予辐射，灌胃0.9%氯化钠溶液0.1 ml。海龙黄精散给药剂量：小鼠按生药0.6 g/kg剂量每日灌胃1次，每次灌食药液0.1 ml。8周龄BALB/c雄性小鼠体重约25 g，经计算海龙黄精散剂量应为0.015 g，与0.1 ml的0.9%氯化钠溶液混匀后灌胃。海龙黄精散小剂量组(0.3 g/kg)：造模同时灌胃小剂量海龙黄精散药液0.1 ml；海龙黄精散中剂量组(0.6 g/kg)：造模同时灌胃中剂量海龙黄精散药液0.1 ml；海龙黄精散大剂量组(1.2 g/kg)：造模同时灌胃大剂量海龙黄精散药液0.1 ml。五组小鼠均连续灌胃18 d，1次/d。

1.2.2 小鼠精子参数比较：用颈椎脱臼法处死小鼠，立即将各组小鼠两侧附睾和附睾管剖开，用0.1 ml的0.9%氯化钠溶液冲洗后，滴液于精子计数板Makler上，检测精子浓度；应用计算机辅助分析检测精子活力，包括前向运动精子(PR)、非前向运动精子(NP)，精子总活力=PR+NP。

1.2.3 小鼠睾丸组织病理学形态观察及Johnson评分评估：取小鼠双侧睾丸，右侧置于4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋，将睾丸切成厚度为4 μm的石蜡切片，苏木-伊红(HE)染色后镜下观察生精小管内生精细胞(精原细胞、精母细胞、精子细胞、精子)、支持细胞损伤情况。并采用Johnson评分法[10]评价精子发生障碍程度：生精功能正常为10分；各期生精细胞存在，但排列紊乱为9分；生精小管中有少量精子(5～10个)为8分；无精子，但有许多精子细胞为7分；无精子，仅有少量精子细胞(5～10个)为6分；无精子细胞，但有许多精母细胞5分；无精子，仅有个别精母细胞(<5个)为4分；仅有精原细胞为3分；无生精细胞，仅有支持细胞为2分；管腔内无细胞为1分。评分越高，精子发生越好，反之精子发生障碍程度越严重。

1.2.4 小鼠睾丸组织IL-6、IL-12、TNF-α水平检测：滤纸吸干左侧睾丸组织水分，用电子天平称重后剪碎，按1∶99添加0.9%氯化钠溶液，超声粉碎制备1%的组织匀浆，3000 r/min离心10 min，取上清液，采用ELISA法分别检测组织IL-6、IL-12、TNF-α水平，具体操作按照试剂盒说明书进行。

2 结 果

2.1 各组小鼠精液参数比较 见表1。干预后，模型组小鼠精液PR、NP、精子总活力均较空白组降低(P<0.05)，海龙黄精散小剂量组小鼠NP较模型组升高(P<0.05)，海龙黄精散中、大剂量组小鼠PR、NP、精子总活力均较模型组升高(P<0.05)。

表1 各组小鼠精液参数比较(%)

2.2 各组小鼠睾丸生精小管组织病理学观察 空白组小鼠生精小管厚度适中，细胞排列较整齐，管腔无明显增大，可见各级生精细胞和精子，支持细胞排列整齐。模型组小鼠生精小管变薄，细胞排列松散，管腔增大，生精细胞和精子数量减少，甚至各级生精细胞大部分消失，支持细胞部分缺失。海龙黄精散小剂量组小鼠生精小管变薄，细胞排列松散，管腔增大，生精细胞和精子数量减少，支持细胞少部分缺失，较模型组稍改善。海龙黄精散中剂量组小鼠生精小管变薄，细胞排列松散，管腔稍增大，生精细胞和精子数量减少，支持细胞排列尚整齐。海龙黄精散大剂量组小鼠生精小管变薄好转，细胞排列稍松散，支持细胞排列尚整齐，管腔无明显增大，生精细胞和精子数量稍减少(图1)。

图1 各组小鼠睾丸生精小管组织病理学形态(HE染色，×400)

2.3 各组小鼠生精小管Johnson评分比较 见表2。与空白组比较，模型组小鼠Johnson评分下降(P<0.05)；与模型组比较，海龙黄精散小、中、大剂量组小鼠Johnson评分均升高(P<0.05)。

表2 各组小鼠生精小管Johnson评分比较(分)

2.4 各组小鼠睾丸组织TNF-α、IL-6、IL-12水平比较 见表3。与空白组比较，模型组小鼠睾丸组织TNF-α、IL-6、IL-12水平升高(P<0.05)；与模型组比较，海龙黄精散小、中、大剂量组小鼠TNF-α、IL-12水平均降低(P<0.05)；与模型组比较，海龙黄精散中、大剂量组小鼠IL-6水平降低(P<0.05)。

表3 各组小鼠睾丸组织TNF-α、IL-6、IL-12水平比较(pg/ml)

3 讨 论

少弱精子症属中医学“无子”“艰嗣”“精冷”“精少”等范畴[11]。《素问·上古天真论》云：“男子二八肾气盛，天癸至，精气溢泻，阴阳和，故能有子”，认为肾中精气与男子生殖功能密切相关，若是精亏气少则难以有子。调查发现，少弱精子是近年来男性不育症较为常见的病因之一[12]。其中肾虚精亏证是少弱精子症最常见的中医证型[13]。睾丸是微波辐射的靶器官之一，微波辐射可以造成睾丸损伤[14]。本研究使用频率为2450 MHz的连续微波，功率密度为40 mW/cm2，建立少弱精子症小鼠模型，探讨海龙黄精散对少弱精子症的作用机制。

中医认为肾藏精，主生殖。肾主封藏，具有摄纳、贮存、闭藏精气的功能[15]。肾中所藏精气之来源，一是禀受于父母的生殖之精，二是从食物中摄取的营养成分和脏腑生理活动过程中化生的精微物质。肾为藏精之本，精气藏于肾，促进肾中精气的不断充盈，防止精气无故流失，为精气在体内充分发挥其生理功能创造必要条件[16]。肾精不足可由先天禀赋不足或五劳七伤等引起，肾精亏虚、命门火衰，亦可因后天脾胃虚寒，化源不足，致肾精不充。海龙黄精散由海龙和黄精两味中药组成。海龙，入肾、肝两经，补肾壮阳，补先天之精；黄精，入肺、脾、肾经，补气养阴，健脾润肺、益肾气，先后天同补。两药同用，阴阳调和，以后天之精补先天之精，共同发挥补肾填精的功效，治疗男性不育效果显著。

高雅静等[17]研究发现，高功率微波辐射可致大鼠精子总量、密度和活动率均下降，补肾生精中药干预后，以上指标得到改善。本研究显示，微波辐射后小鼠生精小管结构受到不同程度的破坏，生精小管变薄，细胞排列松散，管腔增大，生精细胞和精子数量减少，甚至出现各级生精细胞大部分消失，Sertoli细胞部分缺失。海龙黄精散干预后，生精小管细胞得到改善，精子活率提升。提示微波辐射可能损害小鼠精子发生睾丸微环境中的Sertoli细胞，海龙黄精散可逆转微波辐射对小鼠生精细胞的损害。

本研究发现，模型组小鼠睾丸组织TNF-α、IL-6和IL-12水平均高于空白组，中、大剂量海龙黄精散组小鼠睾丸组织TNF-α、IL-6和IL-12水平均低于模型组，提示微波辐射可增加小鼠睾丸组织促炎细胞因子的表达，海龙黄精散可抑制微波辐射引起的炎症反应。细胞因子是具有介导炎症反应和免疫应答功能的机体蛋白质活性产物，作用于睾丸的生精微环境，对精子的产生、成熟、获能、运动等方面有着重要的生理作用[18]。TLR是“模式识别受体”，可以识别高度保守的病原体相关分子模式[19]。TLR配体的激活可以触发一个共同的信号通路，从而上调IL-1、IL-6、IL-12、TNF-α等炎症因子的表达。睾丸内曲细精管的Sertoli细胞是生精微环境的重要组成部分，能为精子生成的提供免疫网络，维持生精功能的正常运行[20]。Wu等[21]研究表明，微波辐射诱导Sertoli细胞中TLRs信号通路的激活，上调细胞因子IL-6、IL-12和TNF-α表达，进而影响精子形成，本研究结果与其一致。Jin等[22]实验表明小鼠精子质量的下降可能是由于二噁英通过Klotho/PDLIM2/p65途径影响支持细胞中促炎细胞因子和IL-12分泌，从而促进睾丸炎症反应，影响睾丸微环境并诱导生殖细胞凋亡。

综上所述，海龙黄精散可以提高少弱精子症小鼠精液质量，升高Johnson评分，降低睾丸TNF-α、IL-6、IL-12水平。本研究为海龙黄精散治疗男性少弱精子症提供了理论基础。