电针调控CASP-1/GSDMD细胞焦亡信号通路对抑郁症小鼠干预机制

田丹丹，杨 阳

(西北妇女儿童医院中医科，陕西 西安 710061)

抑郁症是危害人类健康的重大精神疾病之一，其发病率增长过快，对社会和家庭造成了不可估量的损失,其特征是情绪持续低落、反复出现死亡和自杀念头、社会孤立感和快感缺乏[1]。常常伴随兴趣降低或丧失、睡眠障碍、消化功能减弱、自杀倾向等表现。

抑郁症发病机制复杂，在抑郁症的机制研究中，主要包括神经递质失调、海马神经发生障碍、突触可塑性受损及神经炎症等假说。越来越多的研究证实，神经炎症是抑郁症发病的重要机制。近年来，针灸通过改善神经炎症发挥抗抑郁作用受到人们广泛关注。小胶质细胞是中枢神经系统(Central nervous system，CNS)的固有免疫细胞，大量研究提示，神经炎症反应的发生与激活的M1型小胶质细胞关系最为密切，M1型小胶质细胞会产生大量的促炎因子，致使神经元功能受损，引起CNS疾病[2]。有研究表明，病理情况下，小胶质细胞的正常结构及功能受到损害，可导致相关的突触可塑性损伤和神经炎症，引发抑郁症。该研究结果提示，小胶质细胞过度活化，引起的炎性反应在抑郁症病理过程中具有重要作用。因此，抑郁症可被看作“小胶质细胞疾病”[3]。研究证实，应激通过活化小胶质细胞中的NLRP3炎性小体，激活下游的半胱天冬蛋白酶(Caspase，CASP-1)，进而释放白介素(Interleukin，IL)-1β、IL-18，导致细胞焦亡的发生，进而介导相关免疫炎性反应。

目前，针灸调节抑郁症是否通过抑制小胶质细胞诱导的过度神经炎症，进而导致细胞焦亡发挥作用尚未有报道。但有研究已证实，针灸对炎性反应以及炎症细胞因子，有一定的调控作用，提示调节相关炎性信号通路可能是针灸治疗抑郁症的重要效应机制[4]。本研究通过腹腔注射利血平(Respine，RESP)成功建立急性抑郁小鼠模型，以CASP-1/GSDMD细胞焦亡信号通路为切入点，观察电针干预对急性抑郁小鼠行为学、海马CA1区神经元树突棘及CASP-1/GSDMD细胞焦亡信号通路相关蛋白表达的影响，为进一步研究电针治疗抑郁症的机制提供新的方向。

1 材料和方法

1.1 实验动物 SPF级雄性6～8周龄C57BL/6小鼠共领取3批，每批8只，体重约为20～25 g，饲养于空军军医大学药理学教研室动物房。动物领取后进行随机化分组喂养，室内温度稳定在20～25 ℃，湿度稳定在50%左右，光照12 h昼夜循环，在开始实验前将小鼠适应性喂养7 d，在实验过程中保持所有动物自由活动。之后进行的行为学检测全部在上午实施。本次实验动物的使用及所有的实验方案均经过空军军医大学伦理委员会批准。

1.2 实验试剂与仪器 全自动多功能酶标仪(德国 Thermo 公司)；全自动电泳仪(广州科昊公司)；Bio-Rad 680 酶标仪(美国 BioRad 公司)；冰冻切片机(德国 Leica 公司)；Tanon4200 发光成系统(上海 Tanon 公司)；氟西汀(美国 Selleck 公司)；RESP (美国 Sigma 公司)；Mouse anti-β-actin(美国 Sigma 公司)；Rat anti-CASP-1 (美国 Abcam 公司)；Rat anti-IL-1β (美国 Abcam 公司)；Mouse anti-Iba-1 (美国 Abcam 公司)；Rat anti-GSDMD (美国 CST 公司)。

1.3 配制溶液 ①制备转膜液：在天平上称3.03 g的Tris以及14.4 g的甘氨酸放置在器皿中，加入去离子水使其溶解，然后定容至800 ml，最后加入200 ml甲醇，充分混匀备用。②制备丽春红溶液：在天平上称取0.2 g丽春红放置于器皿中，加去离子水使其溶解，然后用量筒定容至90 ml，最后倒入约10 ml冰乙酸充分混匀，常温保存备用。③制备PBST缓冲液：用器皿制备500 ml PBS缓冲液，然后往其中加入500 μl吐温-20，充分混匀待用。④备牛奶封闭液：将100 ml的PBST缓冲液放置于器皿中，放在摇床上左右摆动，缓慢往其中加5 g脱脂奶粉，混匀至没有颗粒感。

1.4 实验方法

1.4.1 建立动物模型及其分组：①动物分组：C57BL/6小鼠随机分成四组：空白组、模型组、氟西汀组、电针组，氟西汀(20 mg/kg)作为阳性抗抑郁药连续治疗7 d，每组各8只小鼠。②建立急性抑郁小鼠模型：参考相关文献，用浓度为0.5%冰醋酸制备1 mg/ml的RESP溶液，连续3 d腹腔注射1 mg/ml的RESP溶液建立急性抑郁小鼠模型。然后进行行为学检测，检验模型是否制备成功[5]。

1.4.2 针刺方法：按照相关动物穴位图谱选取“百会”和“内关”穴，用一次性使用无菌针灸针0.18 mm×10 mm进行针刺[6]。针刺完成后，接通电针仪的电源连接在针柄上，电针时间15 min，强度为0.3 mA，以小鼠肌肉轻度抽搐为标准对小鼠进行电针治疗。电针结束后，小鼠恢复30 min后，再进行下一步实验。电针组小鼠连续治疗7 d。

1.4.3 强迫游泳实验：强迫游泳实验被用来评估绝望行为，作为最广泛使用的抗抑郁作用测试方法之一。在水温为23～25 ℃的条件下，将各组小鼠分别置于一个高25 cm、直径10 cm、深11 cm的玻璃容器中，强迫小鼠游泳6 min，在测试的最后4 min记录总的不动时间。当小鼠停止游泳保持不动，头露出水面的时间被认为是不动时间。容器里的水在每只小鼠测试完进行更换。

1.4.4 悬尾实验：尾悬实验在安静的房间中进行。每只小鼠被悬挂在离地面50 cm的地方，用一小块胶布黏在小鼠尾巴末端2 cm处将其粘在横杆上，小鼠的视野被一道屏障挡着。悬尾实验持续6 min，在实验的最后4 min记录总静止时间。当小鼠表现出绝望时，它们就被认为是静止不动的。在这种情况下，小鼠停止挣扎以克服这种不正常的姿势，经过一段时间的挣扎活动后，几乎不动或完全不动。

1.4.5 高尔基染色法：制备高尔基染色液，室温避光保存，备用。小鼠处死后快速取出全脑，浸于高尔基染色工作液中，室温浸染12 d(需避光)；去离子水漂洗2次(5 min)；乙醇梯度脱水：70%乙醇24 h，80%乙醇8 h，90%乙醇6 h，95%乙醇5 h，无水乙醇2 h。乙醇和乙醚1∶1混合液中脱水；振动切片机切取含有海马区脑片(在去离子水中切)，厚度120 μm，将切好的脑片放置在去离子水中，备用；将脑片在去离子水中漂洗10 min，70%、96%和100%乙醇梯度脱水，二甲苯透明30 s(漂洗时需震荡，最后乙醇脱水后先放到载玻片，等乙醇挥发后滴上甲苯，再加入中性树胶)；中性树胶封片(滴在脑片的两侧，注意避免气泡)，显微镜明场下观察树突棘密度；整理每组小鼠CA1区神经元树突棘的数量，进行统计分析。

1.4.6 冰冻病理切片制备：行为学检测结束后，每组随机进行心脏灌注，取出全脑放于装有多聚甲醛的EP管中，4 ℃放置8 h，然后放置于20%和30%蔗糖水中脱水，最后冰冻切片机切片，收集脑片，4 ℃保存，免疫荧光染色备用。

1.4.7 免疫荧光：将脑片用含0.3% Triton X-100的滤过的PBS液打孔30 min；打孔完成后，将各组脑片加入标记好的24孔板中，加入正常山羊血清封闭液，常温1 h封闭；封闭完成，吸走封闭液，按照相应比例，配制一抗，每孔加入配制好的一抗，放4 ℃冰箱过夜。次日，继续孵二抗；将24孔板从4 ℃冰箱取出，放在摇床上摇40 min至2 h进行复苏；将脑片用滤过的PBS液在打孔板里洗3次×7 min/次；用滤过的PBS为基础液，按照一定比例，避光配制荧光二抗，避光置于室温1 h；将脑片用滤过的PBS液在打孔板里洗3次×7 min/次；进行贴片，将载玻片按不同的实验组做好标记，再将所有脑片按序贴于载玻片上，稍晾干后，50%的甘油封片，4 ℃避光保存；显微镜下观察结果。

1.4.8 Western blot检测：①样品制备：将标本从-80 °C冰箱取出后置于冰上，组织称重，按组织重量(g)与裂解液体积(ml)为1∶9的比例加入裂解液(RIPA 裂解液+1%蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂，使得最终浓度为1 mmol/L)。用电动组织匀浆机进行匀浆，匀浆每次进行10 s，间隔10 s重复操作，直至无肉眼可见组织碎片即可。将组织匀浆后放于1.5 ml的EP管中，离心机(12000 r/min，4 ℃)离心20 min后，吸取上清液。蛋白定量：准备好BCA工作液(A液∶B液=50∶1)于室温备用，用超纯水将标准品稀释为7个梯度，加入96孔板，做复孔。再用超纯水将上清按原液、1∶5、1∶10、1∶20、1∶50的梯度稀释，加入96孔板，做复孔，混匀后于37 ℃孵育30 min。开启酶标仪，读取OD值。②按操作流程进行电泳、转膜和封闭、染色、一抗和二抗。③使用多功能分子成像仪进行显影读条带。

1.5 统计学方法 将实验数据录入GraphPad Prism 7.03和SPSS 20.0统计学软件进行统计分析。组间比较采用单因素方差分析，实验结果用均数±标准差表示；P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠不动时间比较 悬尾实验结果显示(图1A)，与空白组相比，模型组小鼠的不动时间明显增加(P<0.001)。与模型组相比，电针组小鼠不动时间显著减少(P<0.05)；氟西汀组与电针组结果相似(P<0.01)。在强迫游泳实验中(图1B)，与空白组相比，模型组小鼠的不动时间明显增加(P<0.001)。与模型组相比，电针组小鼠不动时间减少(P<0.001)，氟西汀组与电针组结果相似，小鼠不动时间显著减少(P<0.001)。

A：在悬尾实验中每组小鼠的不动时间； B：在强迫游泳实验中每组小鼠的不动时间。与空白组比较，*P<0.001；与模型组比较，#P<0.05，$P<0.01，&P<0.001

2.2 各组小鼠海马CA1区神经元树突棘密度的比较 研究证实，抑郁症的发生伴随着突触可塑性的异常改变，表现为海马CA1区神经元树突棘密度的减少[7]。在利血平诱导的急性抑郁小鼠模型中，我们评估电针干预是否可逆转抑郁小鼠海马CA1区树突棘密度的减少。对CA1区锥体神经元进行高尔基染色用来评估树突棘密度的变化(图2A)。与空白组相比，模型组小鼠海马CA1区树突棘密度显著减少(P<0.001)；与模型组比较，电针组小鼠海马CA1区树突棘密度显著增加(P<0.05)，氟西汀组与电针组结果相似(P<0.01)(图2B)。

A：用于树突棘密度计算的海马CA1区锥体神经元高尔基染色的代表性标本； B：各组树突棘的代表性图像(左)，各组树突棘密度计数(右)。与正常组比较，*P<0.001；与模型组比较，#P<0.05，$P<0.01

2.3 各组小鼠海马脑区小胶质细胞形态比较 在抑郁症的病理过程中，活化的小胶质细胞引发的神经炎症反应至关重要[8]。采用免疫荧光技术观察小鼠海马区激活的小胶质细胞情况。Iba-1是小胶质细胞激活的特异性标志物[9]。与空白组相比，模型组小鼠海马区小胶质细胞标志物Iba-1表达升高，胞体增大、突起长度减小、细胞数量增加；与模型组相比，电针组小鼠海马区小胶质细胞标志物Iba-1的表达降低，氟西汀组与电针组有相似作用。见图3。

Iba-1 用红色标记，细胞核用蓝色标记，标尺=100 μm

2.4 各组小鼠CASP-1/GSDMD细胞焦亡信号通路相关蛋白表达水平比较 在抑郁症的发展过程中，CASP-1/GSDMD细胞焦亡信号通路被激活是一个潜在的研究机制[10]。Western blot结果显示，与空白组比较，模型组CASP-1、GSDMD、IL-1β蛋白表达水平明显升高(P<0.001)；与模型组比较，电针组CASP-1、GSDMD、IL-1β蛋白表达水平明显下降(P<0.05)，氟西汀组CASP-1、GSDMD、IL-1β蛋白表达水平显著下降(P<0.05)。见图4。

A：各组CASP-1、GSDMD、IL-1β蛋白表达水平；B、C、D：各组CASP-1、GSDMD、

2.5 实验机制图 电针通过抑制CASP-1/GSDMD细胞焦亡信号通路和小胶质细胞的过度活化，降低神经炎症，缓解RESP诱导的急性抑郁小鼠模型抑郁样行为，发挥抗抑郁作用(图5)。

图5 实验机制图

3 讨 论

抑郁症在中医学中属“郁证”范畴，《黄帝内经》中将情志活动归于五脏，督脉与脑在经络上有直接联系，本着“经脉所过，主治所及”的治疗原则，督脉腧穴用于治疗脑病[15]。针灸治疗抑郁症是以脏腑和经脉理论为指导，以调神解郁、疏利气机、调畅情志为原则，取督脉、手足厥阴、手少阴经穴为主[16-17]。百会穴，又名三阳五会，为督脉与手足三阳经及足厥阴经之会，位于巅顶，属于督脉，内通于脑，不仅有调神之功，还能宣阳开郁。针刺百会穴可以起到醒脑利窍、通督调神的功效。内关穴属于手厥阴心包经，为本经络穴，又通阴维脉，为八脉交会穴之一，既宁心安神又能疏通气血、宽胸理气，在抑郁症的治疗中被大量应用[17]。本研究选用电针“百会”“内关”，探究电针治疗对急性抑郁小鼠的作用及可能机制。本研究采用悬尾实验和强迫游泳实验观察抑郁症小鼠的抑郁样行为，结果显示，模型组小鼠不动时间显著增加，说明抑郁症模型成功；相较于模型组，电针组及氟西汀组不动时间明显缩短，说明电针干预可改善抑郁症小鼠抑郁样行为。

研究表明，神经胶质细胞广泛参与中枢神经系统的生理功能，除了对神经元的营养支持外，小胶质细胞作为大脑的驻留免疫细胞，具有消除或修剪脆弱和异常突触的功能[12]。有害刺激可触发小胶质细胞的异常激活，导致炎症细胞因子如IL-1β、IL-6和TNF-α的产生，这些细胞因子诱导炎症攻击、突触神经元损伤[11-18]。在遭受心理社会应激动物的边缘脑区观察到活化的小胶质细胞，在抑郁患者的死后脑组织中，Iba-1阳性的小胶质细胞数量较高[19]。长期给予小胶质细胞活化抑制剂米诺环素完全消除了外周炎症对突触可塑性的影响，表明小胶质细胞在应激下可塑性的动态变化中发挥了关键作用[20]。本研究显示，与正常组相比较，模型组小鼠海马、CA1区树突棘密度显著减少，说明抑郁小鼠海马突触可塑性损伤。与模型组比较，电针组及氟西汀组小鼠海马CA1区树突棘密度显著增加，表明针刺干预后海马突触可塑性有所改善。

近年来研究证实，由小胶质细胞过度活化引起的细胞焦亡广泛发生于中枢系统疾病。有实验结果表明，在TBI模型中，使用CASP-1的抑制剂VX-765阻断其表达后，可以改善大鼠的认知记忆能力，同时可以下调细胞焦亡信号通路相关蛋白的表达[21]。该研究结果提示，探讨细胞焦亡在中枢系统疾病中的作用很关键，通过抑制细胞焦亡信号通路的关键蛋白，从而调控细胞焦亡，改善脑内的神经炎症，可影响疾病的发生发展。GSDMD蛋白是炎症小体激活下游新发现的焦亡关键蛋白，其在抑郁症中的作用和机制尚不清楚。与这些结果相一致，本研究的Western blot和免疫荧光的结果提示，利血平诱导的抑郁小鼠可触发CASP-1/GSDMD细胞焦亡信号通路相关蛋白CASP-1、GSDMD、IL-1β蛋白表达水平升高以及小胶质细胞过度活化。相较于模型组，电针组及氟西汀组小鼠CASP-1/GSDMD细胞焦亡信号通路相关蛋白表达水平显著降低，小胶质细胞活化数量减少。表明电针发挥抗抑郁作用是通过抑制CASP-1/GSDMD细胞焦亡信号通路、改善神经炎症发挥作用。

综上所述，本研究结果表明电针发挥抗抑郁作用，有可能是通过抑制CASP-1/GSDMD细胞焦亡信号通路，降低神经炎症，改善突触可塑性。本实验结果揭示了电针治疗抑郁症可能的分子机制，但是也不排除电针通过其他机制共同发挥抗抑郁作用。今后我们将进一步研究电针在其他疾病中的可能分子机制以及细胞焦亡与其他疾病的潜在联系。