基于转录组测序技术探讨复方蛇龙胶囊治疗膜性肾病大鼠潜在机制

贾世艳，仲启明，司瑞花，范晓阳，严文允，刘光珍

(1.山西中医药大学，山西 晋中 030619；2.山西省中医药研究院，山西 太原 030012)

膜性肾病(Membranous nephropathy,MN)是成人肾病综合征的主要病因之一，仅次于发病率最高的IgA肾病，目前已成为我国肾病的主要类型[1-2]。MN临床常表现为肾病综合征，以大量蛋白尿并伴有低蛋白血症为主要表现，如不及时治疗，还有向终末期肾功能衰竭和尿毒症转归的危险[3-5]。目前MN主要以糖皮质激素、免疫抑制剂为治疗手段，但是疗效较差，复发率高，极易引发严重的不良反应[6]。

近年来，中药复方治疗MN效果显著，安全性高，不良反应少，愈来愈受到临床的重视[7-8]。复方蛇龙胶囊是刘光珍教授总结多年治疗慢性肾脏疾病的临床经验，在“清热利湿，活血化瘀”组方理论基础上形成的，临床疗效确切，能明显改善MN大鼠蛋白尿等相关指标，保护肾小球的功能与结构[9-11]。为进一步揭示复方蛇龙胶囊作用机制，本研究通过构建阳离子化牛血清白蛋白(Cationic bovine serum albumin,C-BSA)诱导膜性肾病大鼠模型，采用高通量转录组测序技术，对复方蛇龙胶囊治疗MN的潜在分子机制进行系统性揭示，不仅对复方蛇龙胶囊的临床应用提供研究基础，同时能够加深对MN发病机制的理解。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：SD大鼠，SPF级，雄性，体重160～180 g，6周龄，共40只，购自军事医学科学院实验动物中心，合格证号：SCXK(京)2017-0005，实验方案符合山西省中医药研究院动物伦理要求。

1.1.2 药物与制备：复方蛇龙胶囊由穿山龙(批号20191101)、鬼箭羽(批号20190901)和白花蛇舌草(批号20190801)组成，均购自山西省中医院药房。将上述3味中药加10倍水煎煮2次，每次2 h，滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密度为1.23～1.28(80 ℃)的清膏，真空干燥，粉碎成粗粉，备用。

1.1.3 主要试剂与仪器：C-BSA(批号102062773)；一水乙二胺(批号6780-13-8)；弗氏不完全佐剂(批号344291)；Forma -80 ℃冰箱(美国Thermo Scientific)。

1.2 实验方法

1.2.1 造模制备、动物分组及给药：大鼠适应性喂养1周后，进行24 h尿蛋白定量，剔除大于5 mg的蛋白尿阳性大鼠，模型制备参照改良Border法[12]，预免疫阶段，取C-BSA 1 mg溶解于0.5 ml 0.9%氯化钠溶液中，与等量弗氏不完全佐剂在注射器中来回推动充分乳化成乳白色的悬浊液后，大鼠颈背部、腹股沟和腋下等多点皮下注射0.1 ml，隔日1次，共3次；正式免疫阶段，将C-BSA与等体积的磷酸盐缓冲液混匀，大鼠尾静脉注射，注射剂量16 mg/kg，每周3次，连续4周。将造模大鼠随机分为模型组和复方蛇龙胶囊高、中、低剂量组，每组10只，模型组给予等体积的0.9%氯化钠溶液灌胃，给药剂量根据人与大鼠的体表面积换算成等效给药剂量[13]；复方蛇龙胶囊高、中、低剂量组分别给予1.5、0.75、0.375 g/kg复方蛇龙胶囊，每天1次，连续8周。

1.2.2 肾组织样本采集：末次给药24 h后，严格遵守实验动物操作规程麻醉大鼠，快速完整采集各组大鼠肾脏组织，滤纸吸去多余水分，组织采用液氮速冻后转-80 ℃冰箱保存备用。

1.2.3 转录组测序及数据分析：肾组织高通量转录组测序采用华大基因公司(深圳)BGISEQ-500测序平台完成。采用Qiagen RNeasy Micro kit试剂盒提取肾组织总RNA，Nano Drop和Agilent 2100生物分析仪对提取的总RNA进行合格定量，构建mRNA文库。测序完成后，采用SOAPnuke对测序数据进行过滤，HISAT将clean reads与GCF_000001895.5_Rnor_6.0大鼠基因组进行比对和注释，Bowtie 2对参考编码基因进行校正，RSEM计算各个样品的基因表达水平。

1.2.4 差异表达基因分析：使用PossionDis算法进行差异表达基因(Differentially Expressed Genes,DEGs)筛选，筛选标准为：log2基因表达差异倍数(Fold change,FC)绝对值≥2.00，FDR≤0.001，对DEGs进行后续的基因本体论功能(Gene Ontology,GO)功能和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)生物通路富集分析。

1.2.5 GO功能和KEGG富集分析：使用Blastx对Unigene进行KEGG注释，Blast2 GO以及NR注释结果进行GO注释，GO和KEGG富集分析采用R语言中phyper函数，Q值≤0.05认为在候选基因中显著富集。

1.2.6 建立复方蛇龙胶囊治疗MN机制中蛋白-蛋白互作网络(Protein-protein interaction,PPI)和筛选关键基因：将DEGs上传至STRING在线数据库，设置相互作用可信区间为中度(Medium confidence 0.400)，绘制差异表达基因PPI网络图，把STRING数据库计算结果导入Cytoscape 3.8.2软件，利用Cytoscape-hubba插件筛选出PPI网络中处于关键位置的前10个基因。

2 结 果

2.1 确定DEGs筛选结果 当|log2FC|≥2.00，FDR≤0.001时，与模型组相比，复方蛇龙胶囊低剂量组肾组织中显著表达DEGs共1353个，其中上调基因1039个，下调基因314个；复方蛇龙胶囊中剂量组肾组织中显著表达DEGs共1410个，其中上调基因1089个，下调基因321个；复方蛇龙胶囊高剂量组肾组织中显著表达DEGs共1575个，其中上调基因833个，下调基因742个。将上述3组数据进行交叉比对，得到685个共表达显著差异基因，其中535个上调基因，150个下调基因。见图1。

图1 不同剂量组筛选出的差异表达基因韦恩图分析

2.2 差异表达基因的GO和KEGG富集分析 GO功能主要分为细胞组分(Cellular component,CC)、生物过程(Biological process,BP)和分子功能(Molecular function,MF)三大类别。对535个共表达上调基因和150个共表达下调基因分别进行GO功能和KEGG富集分析。GO功能富集分析显示，显著上调基因主要富集在细胞膜结构，参与细胞粘附、正向调控细胞迁移和钙离子结合等生物过程；显著下调基因主要富集在细胞膜组分，参与调控跨膜运输过程和跨膜转运蛋白活性。KEGG富集分析结果显示，显著差异表达基因主要富集在PI3K/Akt和MAPK信号通路，按Q值≤0.05视为显著富集，展示前5个条目。见表1、2。

表1 上调差异基因的GO功能和KEGG信号通路富集

表2 下调差异基因的GO功能和KEGG信号通路富集

2.3 DEGs的PPI网络分析结果 利用STRING在线数据库，预测685个共表达显著差异基因的蛋白质相互作用，构建了一个由501个节点和1283条边组成的共表达网络(删除网络中不连接的基因)。利用Cytoscape软件对PPI进行可视化分析，应用Cytoscape-hubba插件筛选出网络中的关键基因，由多种模式算法结果；按连接度(Degree)模式筛选出前10个关键基因，分别是Egfr、Fn1、Rac3、Frk、Cdh1、Agt、Hspg2、Itga8、Akt3和Fgfr2。见表3(图2)。

表3 PPI网络核心基因连通度统计结果

图2 PPI网络Degree模式下前10个基因连通度

2.4 关键基因生物学功能分析 GO功能富集分析显示关键基因主要富集在细胞膜表面及间质，参与跨胞外基质组织及黏附过程，调控激酶活性；KEGG富集分析结果显示关键基因主要富集在PI3K/Akt信号通路，按Q值≤0.05视为显著富集，展示前5个条目。见表4。

3 讨 论

近年来，MN的患病率逐年上升，其发病机制复杂，尽管对症治疗能够缓解部分临床症状，但约30%的患者进展到终末期肾脏疾病，最终依赖肾透析，严重影响生活质量，因此寻求更加安全有效的治疗药物来延缓疾病进展、改善预后成为亟需解决的难点[14]。中药复方成分复杂，作用靶点及通路众多，有必要从整体上阐释中药复方的作用机制，提升中药复方的科学内涵。本研究采用转录组测序技术，探讨复方蛇龙胶囊对MN大鼠肾组织中DEGs表达的影响，结合生物信息学分析，旨在为复方蛇龙胶囊治疗MN的深入研究提供思路。

Itga8属于整合素家族，主要表达于肾系膜细胞，为肾毛细血管内皮提供机械稳定和功能支持，可调控细胞基质黏附、凋亡和自噬等生物学过程，是维持肾小球稳态的重要分子，表达水平可作为肾小球疾病预后的危险分层标志物[15]。目前，研究证实肾足细胞损伤是参与各种原发性或继发性肾小球疾病等肾病综合征进展的关键因素，足细胞数量减少和细胞结构损伤是不可逆的，是促进MN恶性生物学进展的重要因素[16-17]。研究表明，足细胞可表现出较高的基础自噬活性，对维持足细胞结构、功能以及代谢稳态有重要的调控作用，足细胞自噬调控异常是足细胞损伤的关键因素[18]。Rac3属于Rac蛋白家族，对细胞分化、增殖、凋亡和自噬等行为具有重要的调控功能，细胞自噬和凋亡是细胞程序性死亡的重要机制，自噬-凋亡动态平衡对MN的发生发展具有重要影响。研究表明Rac3表达水平升高能够通过NF-κB信号通路抑制细胞凋亡和自噬[19]。成熟的足细胞是终末分化的上皮细胞，无法通过细胞增殖来补充细胞数量，因此复方蛇龙胶囊可能通过抑制细胞凋亡减轻MN大鼠足细胞损伤。Agt是合成所有血管紧张素多肽所必需的底物，循环中的Agt不能通过肾小球滤过屏障，而尿Agt主要来源于肾脏，因此尿Agt水平能够反映肾脏纤维化的情况，可能作为肾脏损伤尤其是慢性肾损伤程度的指标[20]，因此推测复方蛇龙胶囊通过降低肾脏中Agt表达水平，进而减轻肾损害。

针对关键基因的KEGG信号通路富集分析结果显示，复方蛇龙胶囊治疗MN主要通过调控PI3K/Akt信号通路，从而影响足细胞细胞增殖、自噬和凋亡等生物学过程。Akt是PI3K的直接靶基因，处于信号通路的中心环节，外界因素通过激活PI3K而使Akt磷酸化。研究表明，激活PI3K/Akt信号通路能够上调足细胞自噬作用，抑制细胞凋亡，从而保护肾小球足细胞并改善蛋白尿[21]。

表4 前10个关键基因的GO功能和KEGG信号通路富集

本研究结果显示，复方蛇龙胶囊组Egfr、Fgfr2、Akt3表达水平明显上升，提示复方蛇龙胶囊可能通过细胞表面受体Egfr和Fgfr2激活Ras蛋白，导致磷酸化级联反应进而激活PI3K/Akt信号通路，提高足细胞自噬水平，加速对受损细胞器、蛋白质的清除，促进足细胞修复，从而保护足细胞。

综上所述，本研究发现复方蛇龙胶囊可能通过PI3K/Akt信号通路，调控Akt3等关键基因表达，诱导足细胞自噬水平升高，抑制足细胞损伤，为复方蛇龙胶囊治疗MN提供了实验依据。本研究得出的结论未通过相关基础研究予以验证，有待后续进一步研究。