锶掺杂纳米生物活性玻璃改性复合树脂机械性能的实验研究

刘龙帅, 王路明, 高佳伟, 王 涵, 谭 佳, 田梓辰, 左艳萍

(1. 西安医学院口腔医学院, 陕西 西安, 710021; 2. 西安医学院第二附属医院 口腔科, 陕西 西安, 710038)

人牙齿主要的无机成分是羟基磷灰石(HA), 而龋病是牙体硬组织脱矿的常见临床问题，因此HA的再形成成为牙体硬组织脱矿再矿化修复的有效途径。锶(Sr)是人体必须的微量元素，研究[1-3]表明，锶与钙有类似的生理途径，且锶比钙具有更好的生物相容性，亦无细胞毒性，同时具有一定的抗龋能力[4-5]。复合树脂是口腔临床常用的牙体缺损充填修复[6]与黏结材料，但与牙科其他修复材料比较，也存在明显不足，如材料本身容易产生聚合收缩，充填体的边缘封闭性容易遭到破坏，形成微渗漏[7], 再加上口腔微环境中存在大量细菌，容易黏附和聚集在牙齿表面，导致菌斑生物膜[8]的产生，进而导致牙体硬组织脱矿，形成继发龋[9]。因此，在复合树脂中添加具有抗菌效应且能促进脱矿牙体硬组织再矿化的组分是提高牙科复合树脂充填成功率的有效方法[10]。

生物活性玻璃(BG)主要成分为二氧化硅(SiO2)、氧化钙(CaO)、五氧化二磷(P2O5)等[11-12], 可在组织-玻璃界面沉积HA, 对于脱矿牙体硬组织有再矿化的潜力[13]。若将锶与生物活性玻璃的优点结合起来并帮助复合树脂改性，势必会提高脱矿牙体硬组织再矿化及抗菌的能力，从而改善目前复合树脂的不足。本实验通过溶胶-凝胶十二胺模板法合成锶掺杂纳米生物活性玻璃(SrNBG), 再对复合树脂进行改性，对SrNBG改性后的复合树脂机械性能进行研究，筛选出合适的SrNBG替换占比，为SrNBG改性复合树脂的再矿化及抗菌能力研究提供实验依据。

1 实验材料、仪器及方法

1.1 材料

十二胺[CH3(CH2)11NH2]、正硅酸乙酯(C8H20O4Si)、磷酸三乙酯(C6H15O4P)、四水硝酸钙[Ca(NO3)2·4H2O]、硝酸锶[Sr(NO3)2]原料均来自上海凛恩科技发展有限公司(中国)，无水乙醇(C2H6O)及去离子水来自国药集团化学试剂有限公司(中国), γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷[KH-570, CH3CCH2COO(CH2)3Si(OCH3)3]来自盖州市恒达化工有限责任公司(中国)，由双酚A双甲基丙烯酸缩水甘油酯和双甲基丙烯酸二缩三乙二醇酯组成的树脂体系(BisGMA∶TEGDMA=50∶50)、硅化无机填料、由光引发剂樟脑醌CQ及光促进剂胺活化剂DMAEMA组成的引发体系均来自Esstech公司(美国)。

1.2 仪器

实验包括以下仪器: 电子天平(XB220A, 上海精科天美天平仪器厂，中国); 集热式恒温加热磁力搅拌器(DF-101S, 上海力辰邦西仪器科技有限公司，中国); 涡旋振荡器(Vortex-MD，上海力辰邦西仪器科技有限公司，中国); 超声振荡器(KQ5200DE, 昆山超声仪器有限公司，中国); 离心机(HC-2518, 安徽中科中佳科学仪器有限公司，中国); 冷冻干燥机(SCIENTZ-12N, 宁波新芝生物科技股份有限公司，中国); 马弗炉(KSL-1200X, 合肥科晶材料技术有限公司，中国); 振荡培养箱(ZQTY-70S, 上海知楚仪器有限公司，中国); 电热鼓风干燥箱(DHG-9140A, 上海一恒科学仪器有限公司，中国); 计算机控制电子万能实验机(AGS-10kNG/500N, 津岛公司，日本); 多功能数显显微硬度仪(MHVD-1000IS, 上海钜晶精密仪器制造有限公司，中国); 电子数显卡尺(SR44, 桂林广陆数字测控股份有限公司，中国); 光固化机(LED-F, 啄木鸟医疗器械有限公司，中国); 定制的聚四氟乙烯模具。

1.3 SrNBG的合成

采用溶胶-凝胶十二胺法合成不同摩尔比的SrNBG, 见表1。将2.2 g十二胺、12.5 mL去离子水和40 mL无水乙醇加入到烧瓶中，放置于45 ℃的磁力搅拌器上充分搅拌20 min, 接着缓慢滴加1 mL正硅酸乙酯，搅拌40 min后继续缓慢滴加103 μL磷酸三乙酯，搅拌40 min, 按照表1中不同的锶掺杂比依次加入已充分水解的硝酸钙和硝酸锶，搅拌4 h后离心(10 000转/min, 15 min), 去上清后加入无水乙醇洗涤3次，每次使用超声振荡器及涡旋振荡器充分振荡后离心(10 000转/min, 5 min), 去上清，再使用去离子水洗涤3次，得到纳米生物活性玻璃(NBG)以及不同锶掺杂摩尔比(2 mol%、5 mol%以及10 mol%)的SrNBG凝胶，置入冷冻干燥机中进行干燥，最后马弗炉650 ℃煅烧去除结晶水和硝酸根，得到白色NBG以及3个实验组SrNBG粉末(简称2SrNBG、5SrNBG及10SrNBG)。

表1 各组不同锶掺杂摩尔比的NBG mol%

1.4 SrNBG的微观表征

取适量的NBG及3个实验组的SrNBG粉末，加入含有无水乙醇的小烧杯中，超声振荡器振荡40 min充分分散，用毛细玻璃管吸取已振荡均匀的混合液，滴于铜网表面的碳支持膜上，确保样本均匀分布在支持膜上，待无水乙醇挥发完后，使用解析型穿透式电子显微镜AEM(JEM-3010, JEOL公司，日本)对材料的形貌、粒径及分散性进行观察。另取适量样本，采用场发射扫描电子显微镜X射线光电子能谱仪EDS(MERLIN Compact, ZEISS公司，德国)进行面扫描，对样本元素成分进行分析。

1.5 体外HA活性测试

按参照文献[14]的标准，将NBG及SrNBG粉末按照1 mg/mL的浓度分别加入含有10 mL模拟体液(SBF)[15]的聚乙烯瓶中，固定在恒温振荡培养箱中持续摇动(120转/min, 37 ℃)1周，对反应后的溶液进行过滤，丙酮冲洗终止反应，用去离子水反复洗涤离心(10 000转/min, 5 min)3遍，之后将其放入60 ℃干燥箱中干燥3 h得到最终材料，使用X射线衍射仪XRD(Bruker D8 ADVANCE, Bruker AXS公司，德国)对反应后材料进行10～70 °连续扫描，工作条件: Cu靶Kα射线，管电压40 kV, 管电流100 mA。通过XRD图谱中呈现HA特征峰判断材料的体外HA活性[16], 筛选出SrNBG中最适宜的锶掺杂比，将其硅烷化处理后备用。

1.6 SrNBG改性复合树脂的配制

在实验室避光环境下，按5%、10%、15%的质量占比替换复合树脂中的无机填料(见表2)形成3个实验组(实验组1为10SrNBG-5改性树脂，实验组2为10SrNBG-10改性树脂，实验组3为10SrNBG-15改性树脂)，未替换的复合树脂为对照组(10SrNBG通过上一步实验筛选得出)。

表2 实验用复合树脂的各组分质量占比 %

1.7 复合树脂机械性能测定

1.7.1 径向拉伸强度(DTS): 依据美国国家标准[17]制作尺寸为直径6 mm、高度3 mm的试件(n=10)。将复合树脂充分填塞于定制的聚四氟乙烯磨具中，光固化灯往复充分光照固化(正反面各40 s)后脱模，试件各面使用600目水砂纸打磨光滑，卡尺复测试件尺寸，保存在37 ℃水浴中24 h。使用电子万能实验机进行径向拉伸强度测试(速度0.5 mm/min, 传感器量程10 kN), 根据公式DTS=2F/πDH计算并记录破坏载荷F(N)。

1.7.2 压缩强度(CS): 依据美国国家标准[17]制作尺寸为直径4 mm、高度6 mm的试件(n=10)。将复合树脂充分填塞于定制的聚四氟乙烯磨具中，光固化灯往复充分光照固化(正反面各40 s)后脱模，试件各面使用600目水砂纸打磨光滑，卡尺复测试件尺寸，保存在37 ℃水浴中24 h。使用电子万能实验机进行压缩强度测试(速度0.5 mm/min, 传感器量程10 kN), 根据公式CS=F/πR2(R=1/2D)计算并记录破坏载荷F(N)。

1.7.3 挠曲强度(FS): 依据ISO4049(2000)标准[18]制作尺寸为长度25 mm、宽度2 mm、高度2 mm的试件(n=10)。将复合树脂充分填塞于定制的聚四氟乙烯磨具中，光固化灯往复充分光照固化(正反面各40 s)后脱模，试件各面使用600目水砂纸打磨光滑，卡尺复测试件尺寸，保存在37 ℃水浴中24 h。使用电子万能实验机进行挠曲强度测试(跨距为20 mm, 速度0.5 mm/min, 传感器量程10 kN), 记录破坏载荷F(N), 根据公式FS=3FL/2WH2进行计算(L为跨距)。

1.8 统计学分析

采用SPSS 21.0软件对数据进行统计学分析，并经过方差齐性及正态性检验后进行单因素方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 材料AEM表征

AEM微观照片显示, NBG及各组SrNBG粒径均显示约200 nm, 颗粒较均匀，球形形态规则，分散性好(见图1)。EDS元素分析图显示，合成的NBG及各组SrNBG组分均与生物活性玻璃主要成分相符，且NBG中已成功掺入锶元素(见图2)。

A: NBG; B: 2SrNBG; C: 5SrNBG; D: 10SrNBG。图1 SrNBG 的AEM照片

A: NBG; B: 2SrNBG; C: 5SrNBG; D: 10SrNBG。图2 EDS元素分析图

2.2 体外HA活性

机械性能测试均采用5SrNBG进行测试。从XRD物相分析图谱中可以看出, NBG、2SrNBG、5SrNBG均出现了HA特征峰，当锶掺杂比为10 mol% SrNBG(简称10SrNBG)时, HA特征峰不明显。因此，体外HA活性实验说明, 5 mol%SrNBG(简称5SrNBG)与NBG具有相同活性，且为最适宜的锶掺杂比，见图3。

2.3 SrNBG改性复合树脂机械性能

测试结果表明，在SrNBG替换无机填料质量占比为5%(SrNBG-5)时，机械性能出现小幅升高，替换质量占比为10%(SrNBG-10)时, 3项机械性能开始下降，但与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05), 但当SrNBG替换质量占比增至15%(SrNBG-15)时, DTS和FS性能再次下降，且与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05), 见图4。因此SrNBG最大替换质量占比为10%时不影响原复合树脂的机械性能，能够满足临床要求。

A: 径向拉伸强度DTS; B: 压缩强度CS; C: 挠曲强度FS。对照组: 未改性树脂; 实验组1: SrNBG-5改性树脂; 实验组2: SrNBG-10改性树脂; 实验组3: SrNBG-15改性树脂。图4 改性复合树脂机械性能(n=10)

3 讨 论

1969年，佛罗里达大学发明了第一种生物活性玻璃[19], 成分为SiO2(46.1 mol%)、Na2O(24.4 mol%)、CaO(26.9 mol%)和P2O5(2.6 mol%), 后来称为45S5生物玻璃，开启了生物玻璃的研究领域。生物活性玻璃具有良好的生物相容性，较高的骨修复能力[19], 具有促进生物矿化及提高细胞活性等优越性能，也被广泛应用于口腔医学领域[20]。20世纪60年代至今，生物活性玻璃的合成有传统的熔融淬火法和溶胶-凝胶法。早期生物玻璃45S5和其他商用生物活性玻璃都是通过熔融淬火法制成的，即在1 300 ℃以上高温下将氧化物熔合在一起，然后在石墨模具或水中进行淬火。此方法的要求比较高，能耗大[21], 合成出来的生物玻璃结构密实无孔[22], 组成也不均匀，表面积小[23], 容易形成团聚等; 溶胶-凝胶法合成的58 S、77 S可以在室温下形成和组装纳米二氧化硅粒子，在此过程中，前体的溶液在室温下进行聚合反应形成凝胶，凝胶可以干燥和加热，加热到600℃成为玻璃。因此，溶胶-凝胶法优势明显，制备的生物玻璃具有固有的纳米孔径，而熔融淬火法制备的生物玻璃很致密[24]。同时溶胶-凝胶法也具有很大的通用性[25], 只需改变合成环境的pH值，生物活性玻璃就可以制成纳米多孔粉体、单颗粒或纳米颗粒。本实验采用了溶胶-凝胶十二胺模板法，改善了熔融淬火法的不足。同时，十二胺兼具模板剂和催化剂的双重作用[26], 十二胺能够调节碱性环境，从而控制生物活性玻璃的粒径和分散性[26-27]。因此使用该方法合成的NBG及SrNBG均呈现出较为规则的粒径约200 nm的球型颗粒，大小较均一，分散性良好，得到了理想的纳米生物活性玻璃。

目前复合树脂是口腔临床最为常用的牙体修复材料，主要由树脂基质和硅烷化无机填料构成，其中无机填料的占比、颗粒大小及形态、分布是否均匀均可对复合树脂的机械性能产生影响[22], 因此填料占比并不见得越高越好。常见的无机填料质量占比为35%～90%[28], 本实验选用最常用的70%为实验质量占比, SrNBG则是对无机填料进行不同占比的替代。

从3项机械性能测定的结果上看, SrNBG替换复合树脂无机填料质量占比为5%、10%时，径向拉伸强度(DTS)、压缩强度(CS)、挠曲强度(FS)与对照组均未显示统计学差异。在替换质量占比为5%时, 3项机械性能反而均有不同程度的升高，其可能的原因是在掺入少量纳米颗粒后，填补了树脂基质中的空隙，二者形成均匀连续相在树脂基体中[29]，起到了加强的作用。替换质量占比增加到10%时，均匀连续相出现小幅破坏，导致机械性能出现不同程度的下降，但仍与对照组机械性能未显示统计学差异。当替换质量占比增加到15%时, DTS和FS再次降低，结果与对照组有统计学差异，与郭永锦等[30]研究结果有一致性。而CS虽然也出现了下降，但与对照组未显示统计学差异, DTS和FS显示出差异的原因可能是随着替换量的增加，纳米颗粒发生了团聚，在聚合收缩时呈现出不均匀的现象[31], 导致在受力时，应力容易集中在这些不均匀的地方，引发断裂及扩展[32], 最终影响了复合树脂的机械性能。CS未见差异的原因可能是因为受力方式不同于DTS和FS, CS是以整个面进行接触测试，受力面积大且平整，应力被更好的分散出去，即使局部出现裂纹，也不会像DTS和FS那样反应那么直接。有研究表明，树脂的压缩性能要高于径向拉伸性能[29], 与本结果存在一致性。

本实验采用溶胶-凝胶十二胺模板法，利用十二胺的双重作用，合成出了形态、粒径、生物活性均理想的SrNBG, 并将其替换不同占比复合树脂中的无机填料对其改性。当SrNBG替换为10%时，改性复合树脂的机械性能不受影响，为下一步SrNBG改性复合树脂的再矿化及抗菌性能研究提供了依据。