黄腐酚对人皮肤鳞癌A431细胞恶性生物学行为的抑制作用*

王攀琦，张 蒙，刘 洋，刘星吟，董 兰，魏瑶璐，宁志丰，刘复兴**

(1.湖北科技学院医学部药学院，湖北 咸宁 437100；2.湖北科技学院医学部基础医学院)

皮肤鳞癌又称表皮样癌，是一类起源于表皮或附属角质形成细胞的恶性肿瘤，在皮肤癌发病率中占第二位[1]。同时皮肤鳞癌具有很强的侵袭和转移能力，一部分患者在治疗后仍会出现复发和耐药情况，严重影响着患者的生活质量。黄腐酚(xanthohumol)是一种从啤酒花提取的天然化合物，具有广泛的生物活性，如抗炎、抗氧化、抗癌、抗菌和降脂等[2]。研究发现，黄腐酚对肝癌、前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、结肠癌、胃癌等多种癌症均具有治疗效果[3]，但目前尚无黄腐酚对皮肤鳞癌的药理作用研究。因此，我们通过体外细胞实验来探讨不同浓度的黄腐酚对人皮肤鳞癌的抑制作用，为黄腐酚治疗皮肤鳞癌在临床上的应用提供实验依据。

1 材料与方法

1．1 实验材料

人皮肤鳞癌A431细胞(湖南丰晖生物)，DMEM高糖培养基(Gibco公司)，胎牛血清(FBS，Procell公司)，胰酶(Biosharp公司)，Transwell小室(Corning公司)，二甲基亚砜(DMSO，Sigma公司)，基质胶(Corning公司)，细胞凋亡与坏死检测试剂盒(碧云天公司)，一抗稀释液(碧云天公司)，GAPDH、JAK2、STAT3、Bcl-2(ABclonal公司)，黄腐酚购置于上海源叶生物科技有限公司(HPLC检测纯度在98%以上)。

1．2 方法

1.2.1 细胞培养

将人皮肤鳞癌A431细胞株常规培养在含10%胎牛血清和1%青霉素链霉素的DMEM高糖培养基，置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，取对数生长期细胞生长状态良好的细胞进行实验。所有实验均重复3次。

1.2.2 细胞增殖能力检测

收集对数生长期的A431细胞，调整浓度为5 000个/孔接种在96孔板中，每组设置6个平行。恒温培养箱培育至每孔达到90%密度，加入经DMSO溶解后浓度分别为0、10、20、40、60、80、100μmol/L的黄腐酚处理24h，然后每孔加入0.5%MTT溶液10μL，继续培养4h，弃去上清，加入150μL/孔的DMSO溶液置于摇床上震荡30min，使用酶标仪于490nm测量吸光度值。

1.2.3 细胞划痕实验

收集对数生长期的A431细胞，调整浓度为1×105个/孔接种在6孔板中，24h培养后，PBS溶液清洗1～2次，更换为不同浓度(0、20、40、80μmol/L)，含黄腐酚的培养液3mL/孔，于培养0h、24h后分别拍取相应时间点的照片。

1.2.4 Transwell侵袭及迁移实验

收集对数生长期的A431细胞，饥饿6h，侵袭组上室加入基质胶，迁移组未加，调整浓度为1×105个/孔接种在Transwell小室上室，在 Transwell 下室分别加入含黄腐酚浓度0、20、40、80μmol/L含20%FBS 的DMEM高糖培养基，放置于24孔板中，常规培养24h。培养结束后，取出小室，弃去培养基，擦去上室基质胶及未穿膜的细胞，甲醇固定后0.1%结晶紫染色，晾干后拍照并计数。

1.2.5 Hoechst33342和PI染色

收集对数生长期的A431细胞，调整浓度为5×104个/孔接种在24孔板中，常规培养24h后弃去培养液，PBS溶液清洗2～3次，加入不同浓度(0、20、40、80μmol/L)黄腐酚的培养基，药物作用12h后按照细胞凋亡与坏死检测试剂盒说明书分别加入Hoechst33342和PI染液进行染色，染色结束后于倒置荧光显微镜下拍照。

1.2.6 Western blot

收集对数生长期的A431细胞，经不同浓度(0、20、40、80μmol/L)黄腐酚处理12h后，提取A431细胞蛋白，进行BCA蛋白定量，加入5×loading Buffer于99.9℃水中煮沸10min后进行蛋白电泳，一抗4℃孵育过夜，二抗常温孵育1h，于蛋白成像系统中曝光，分析结果。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 黄腐酚抑制皮肤鳞癌A431细胞增殖

MTT实验结果显示(图1)，皮肤癌A431细胞的生存增殖能力随着黄腐酚浓度和作用时间的增长呈递减趋势，差异具有统计学意义(P<0.05)，并具有剂量依赖性。并通过在显微镜下观察不同浓度(0、20、40、80μmol/L)黄腐酚作用24h后的细胞，如图2所示。

图1 黄腐酚对A431细胞增殖的影响(与空白对照组相比，*P<0.05，n=6)

图2 经黄腐酚处理后细胞白光照片(10×)

2.2 黄腐酚抑制皮肤鳞癌A431细胞的横向迁移

划痕实验结果如图3所示，与空白对照组的(34.75±3.46)相比，20、40、80μmol/L组处理下的A431细胞随黄腐酚浓度的增加划痕宽度不断增加，愈合面积分别为(29.21±0.97)、(12.50±1.08)、(0.948±0.28)，说明黄腐酚可以抑制A431细胞的横向迁移能力(P<0.05)，并呈浓度依赖性。

图3 经黄腐酚处理后细胞伤口愈合图片(4×)(与空白对照组相比，*P<0.05，n=3)

2.3 黄腐酚抑制皮肤鳞癌A431细胞的侵袭和迁移

Transwell侵袭结果如图4所示，结果显示，与空白对照组相比，20、40、80μmol/L 组处理下的A431细胞随黄腐酚浓度的增加细胞迁移数目不断减少，抑制率分别为(27.70%±4.14%)%、(47.79%±4.13)%、(74.64%±4.11)%，呈剂量依赖性并具有统计学意义(P<0.05)。

Transwell迁移结果如图5所示，结果显示，与空白对照组相比，20、40、80μmol/L组处理下的A431细胞随浓度的增加细胞迁移数目不断减少，抑制率分别为(52.90±7.88)%、(81.54±7.54)%、(27.70±7.04)%，呈剂量依赖性并具有统计学意义(P<0.05)。

图4 黄腐酚处理后A431细胞侵袭状况(10×)(与空白对照组相比，*P<0.05，n=3)

图5 黄腐酚处理后A431细胞迁移状况(10×)(与空白对照组相比，*P<0.05，n=3)

2.4 黄腐酚诱导皮肤鳞癌A431细胞的凋亡和坏死

Hoechst33342结果如图6所示，正常细胞呈现弱蓝色荧光，凋亡细胞呈现强蓝色荧光且形态发生改变，结果所示，与空白对照组相比，20、40、80μmol/L 组处理下的A431细胞随浓度的增加正常细胞数量不断减少。

PI结果如图7所示，坏死细胞呈现红色荧光，结果显示，与空白对照组相比，20、40、80μmol/L组处理下的A431细胞随浓度的增加坏死细胞数量不断增加。

图6 黄腐酚处理后A431细胞凋亡情况(20×)

图7 黄腐酚处理后A431细胞坏死情况(20×)

2.5 黄腐酚调控皮肤鳞癌A431细胞蛋白的表达

Western blot结果如图8所示，与空白对照组相比，黄腐酚刺激后A431细胞STAT3、JAK2和Bcl-2蛋白的表达水平明显下调，且随着黄腐酚浓度的增加，下调趋势越明显，并具有统计学意义(P<0.05)。

图8 黄腐酚处理后A431细胞中STAT3、Bcl-2和JAK2的表达情况(与空白对照组相比，*P<0.05，n=3)

3 讨 论

皮肤鳞癌是常见的非黑色素瘤皮肤癌，通常发生在暴露于阳光的皮肤部位，即头部、颈部和耳部等[4]。近年来，皮肤鳞癌在全球范围内发病率呈上升趋势，2020年世界卫生组织公布非黑素瘤皮肤癌的患病人数为200～300万，黑色素瘤约为13.2万，发患者群还呈现一定年轻化的趋势。同时，我国近几年皮肤鳞癌的发病率也在逐渐上升。皮肤鳞癌诱发原因主要包括以下几个方面：紫外线辐射、自身皮肤肤色因素、年龄、自身免疫、基因异常、病毒感染、某些化学致癌物质等。现在治疗皮肤癌的方法主要是手术治疗、光动力疗法、靶向治疗、中药治疗、联合治疗等[5]，但不良反应较多，给人们的生活质量带来了负担。因此，寻找新的药物治疗皮肤鳞癌显得尤为重要。

黄腐酚又名戊二酰化查尔酮，是一种源于啤酒花中的活性成分。有研究发现，黄腐酚具有多种抗癌活性，比如，Slawińska-Brych等[6]研究发现黄腐酚可以通过喉癌细胞凋亡并阻滞喉癌细胞于G1期来抑制喉癌细胞的生长增殖；Hou等[7]发现黄腐酚可以通过诱导线粒体应激和激活AIF途径诱导大鼠胶质瘤细胞C6的凋亡；Seitz等[8]发现黄腐酚在体内体外均有良好的抑制作用，并且还可抑制黑色素瘤的肝转移；Liu等[9]发现黄腐酚在人结肠癌中可以通过诱导结肠癌细胞凋亡和阻滞细胞于G2/M期和阻断结肠癌细胞中的MEK/ERK通路来抑制结肠癌细胞的生长。同时黄腐酚还具有抗炎、抗菌和降脂的作用，但还未有人研究黄腐酚对皮肤鳞癌的作用。在本研究中，我们观察不同浓度的黄腐酚作用于A431细胞后对细胞活力的影响，发现其随着黄腐酚药物浓度的升高而降低;同时A431细胞经黄腐酚处理后，划痕闭合率显著降低，侵袭和迁移细胞数目明显减少，并且荧光结果显示，A431细胞经黄腐酚处理后，正常细胞数目减少，凋亡与坏死细胞数目增多。

JAK/STAT通路是调节细胞增殖、分化、迁移和凋亡的重要信号通路之一[10]。同时，JAK/STAT通路可以调节下游抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，引起细胞凋亡的抑制[11]。在本研究中，我们发现黄腐酚作用于人皮肤鳞癌A431细胞后，细胞中的JAK2、STAT3和Bcl-2蛋白表达呈降低趋势，因此，我们推测黄腐酚抗人皮肤鳞癌A431细胞的作用可能是通过抑制JAK2、STAT3和Bcl-2蛋白的表达来实现。

综上所述，黄腐酚可抑制A431细胞的生长、迁移及侵袭，且通过抑制JAK2、STAT3和Bcl-2蛋白的表达来促进A431细胞的凋亡，从而为黄腐酚作为潜在的抗皮肤鳞癌药物在临床应用前景上提供了一定的实验依据。