食管癌仿生类器官模型的构建研究

石林林，郝思妤，李佳怡，喻 莹，史嘉铭，高社干,2

食管癌是消化道肿瘤中具有侵袭性和致命性的恶性肿瘤之一，是全球范围内导致癌症患者死亡的第六大原因[1]。中国作为食管癌高发国家，约占全球每年新发病例的54.1%、死亡病例的56%,其中河南省是全球食管癌发病率和死亡率最高的地区之一[2-4]。目前，食管癌的标准治疗方案包括手术、放化疗以及靶向治疗等多学科方法，但患者的总体预后仍不理想，5 a总生存率仅为30%～40%，严重危害人民健康[5]。因其病因及演进机制不明，导致国内外至今在早期诊疗和精准防治方面尚未取得关键性突破，成为困扰食管癌领域科学研究的难点问题。与此同时，食管癌目前缺乏有效的临床前模型来研究其恶性演进机制，以高效准确地预测患者的药物敏感度，实现患者的个体化精准医疗[6-7]。细胞培养从传统液体培养到三维的转变是模拟人体内部微环境的关键环节，三维模型比传统的二维培养环境能更好地重现体内复杂的微环境[8-10]。与传统二维单层培养技术相比，肿瘤类器官技术实现了肿瘤生长过程的可视化，提供了肿瘤干细胞克隆动态和可塑性的研究方法，为寻找肿瘤治疗的潜在靶点提供了新的途径[11-14]。

本研究将微纤维生物复合水凝胶和细胞自组装相结合，构建可负载食管癌类器官来源单细胞悬液的新型光固化生物复合水凝胶。通过对微流控芯片双层同轴流体的精准调控，制备含有水凝胶的中空食管仿生微纤维材料，将其作为食管癌类器官的3D生物载体。基于体外3D细胞培养技术，在三维体系中构建食管癌类器官模型，结合微流控技术，可较好地维持肿瘤异质性，保留肿瘤局部复杂微环境的影响，为食管癌发病机制研究、患者药物疗效检测提供技术保障，为食管癌患者个体化精准医疗方案的制定奠定基础。现报道如下。

1 材料方法

1.1 甲基丙烯酸酐化明胶的制备依次将20 g明胶和10 g无水碳酸钠在50 ℃充分溶解到200 mL超纯水中，倒入装有转子的锥形瓶，在50 ℃热水浴中搅拌直至完全溶解。将4 mL甲基丙烯酸酐缓慢滴加到锥形瓶中，滴加时间控制在2 min。将上述溶液在50 ℃热水浴中持续搅拌1 h，其间每10 min用10%(w/v)的氢氧化钠调节pH至9.0，滴加5次，约需要20 mL氢氧化钠。将上述混合初品在50 ℃热水浴下透析，每2 h换一次水，换水至少20次，将透析产物放在-20 ℃冰箱预冻2 h后再真空干燥5 d。

1.2 毛细管微流控装置的搭建该部分使用的微流控装置是由两根玻璃毛细圆管和一根方管同轴排列在载玻片上构建而成。玻璃毛细圆管的内径和外径分别为600 μm和1 mm。其中一根玻璃毛细圆管首先由拉针仪拉细，然后经烧针器将尖端直径截至300 μm。该一端为300 μm的玻璃毛细圆管作为内相注入管置于载玻片左侧，另一根玻璃毛细圆管被截至45 mm长作为出口置于载玻片右侧。两根圆管同轴插入方管并用环氧树脂胶固定约6 h，即完成微流控装置的搭建。为使内外相形成稳定的层流，内外相的流速设置为0.4 mL·h-1和2 mL·h-1。

1.3 食管鳞癌类器官的构建将类器官完全培养液(RPMI1640基础培养基+100 ng·mL-1Noggin+200 ng·mL-1R-spondin-1+10 μg·mL-1Gentamicin+50 ng·mL-1EGF)在冰上进行预冷，调整食管鳞癌细胞浓度至1×105·mL-1。然后将Matrigel与细胞悬液以1∶9体积充分混合后置于冰上，每孔300 μL滴入提前预冷好的24孔培养板。种板后将培养板置于37 ℃培养箱60 min。当Matrigel充分固化之后，沿培养板壁缓慢加入1 mL食管鳞癌类器官完全培养基，将细胞培养板置于恒温恒湿培养箱内，CO2浓度5%，37 ℃静置培养，每隔5 d更换一次培养液，于显微镜下观察。

1.4 食管癌仿生类器官芯片的制备内相含有100 μL食管癌类器官消化得到的单细胞悬液(5×106个·mL-1)和10% PVA+0.1% CaCl2溶液作为逃逸材料，外相含NaAlg(2%)、GelMa(10%)和HMPP(1%)。所有溶液通过注射泵泵入微流控装置，并在0.1%的CaCl2溶液中进行收集。当流体由出口流出时，在紫外线照射(365 nm、100 W)条件下，纤维进一步光交联5 min，接着转移入2% CaCl2加固2 min，最后用PBS洗两遍，加入培养基，再在纤维表面滴加200 μL血管内皮细胞HUVEC悬液(5×106个·mL-1)，用培养基将固化后的负载细胞微纤维清洗两遍，然后转移至盛有完全培养基的细胞培养板中，放置于培养箱中培养。全程在无菌环境下操作，Alg-GelMa、CaCl2水溶液均经0.22 μm无菌滤头过滤除菌。

1.5 食管癌仿生中空纤维的形貌及功能表征将制得的食管癌仿生生物复合水凝胶单层中空载细胞微纤维用去离子水清洗一遍，然后浸泡在去离子水中用液氮快速冷冻，最后经冷冻干燥完成制样。用导电胶将其固定在载物台上，将样品放入真空离子溅射仪，经喷金处理15 min后，放入扫描电子显微镜内固定，选取适当的放大倍数，挑选合适的视野观察样品表面及截面形貌并拍摄。通过细胞活性实验，分别测定单层中空纤维中食管癌细胞及常规液体培养环境中食管癌细胞的生长情况。

2 结果

2.1 单层中空食管仿生复合水凝胶纤维的制备及表征本研究通过搭建的微流控装置，首先制备了食管仿生中空结构的微纤维，同时负载所构建的食管鳞癌类器官来源的细胞。如图1所示，初步成功制备了具有光滑内壁结构的Alg-GelMa复合水凝胶单层中空微纤维，其管径大小可以通过内外相流速加以控制。在扫描电子显微镜下观察，如图1A所示，上述中空微纤维截面的圆形空洞清晰可见，高倍镜下还可以清楚地观察到中空微纤维具有较厚的管壁，管壁呈多孔结构。将收集到的单层中空纤维在紫外光照条件下进行灭菌处理，并用培养基清洗后移至盛有培养基的培养孔板内，将食管癌类器官来源的3D肿瘤细胞球消化处理制备单细胞悬液，将细胞进行绿色荧光标记(Dio)之后接种于中空纤维中，食管癌细胞可以在纤维状复合水凝胶中黏附生长(图1B)。

A：单层中空仿生复合水凝胶纤维扫描电镜图(从左到右电镜图片倍数逐级放大)；

2.2 单层中空仿生复合水凝胶纤维的细胞负载和活性功能研究本研究初步构建的负载食管癌类器官来源肿瘤细胞的单层中空仿生复合水凝胶纤维如图2A中所示。将肿瘤细胞进行绿色荧光标记，血管内皮细胞进行红色荧光标记，将制备得到的食管癌类器官模型进行荧光染色共定位分析，结果如图2B中所示。本研究制备的食管癌仿生类器官模型，其横截面呈现单层中空结构，内层为食管癌细胞，外层为血管内皮细胞，较好地还原了患者的组织病理结构，且肿瘤细胞在3D模型中的生长情况与常规液体培养条件下差异无统计学意义(P>0.05)，支持所构建的模型具有良好的生物相容性。

A：食管癌仿生类器官芯片3D建模示意图(左：平视图；右：纵切面示意图)；

3 讨论

肿瘤的发生发展是一个涉及多基因改变、多阶段演进积累的复杂病理过程，建立不同阶段的肿瘤模型是解析其发生发展分子机制的关键[15]。传统液体培养条件简单，易于体外扩增，但在培养过程中常丢失肿瘤异质性且无法重现体内复杂的微环境，而动物模型由于移植成功率低、种属差异明显、培养周期长以及成本高，难以大规模用于个体化的药物筛选[16]。肿瘤类器官的出现很好地解决了上述问题，其高度概括了来源肿瘤组织的特征，较好地保留了原位肿瘤组织的生物学特征和个体之间的异质性，培养周期较短，且经多次传代后依然能保持基因组稳定性，因而具有较高的转化应用价值[17]。类器官能够在一定程度上还原特定的细胞类型组成和真实器官的三维结构及功能，其作为研究干细胞命运调控、器官发生、疾病模型的前沿技术，已被作为关键性共性技术之一纳入科技部“十四五”首批重点专项[18]。

本研究首次制备了一种简便的双层微流控系统，包括两种可更换的流体和一个由玻璃毛细管同轴组装而成的微流体装置。通过该系统，使用生物相容性良好的复合水凝胶制备了具有单层中空结构的食管仿生微纤维。在此基础上构建了食管癌类器官来源的3D仿生类器官芯片，后续可将其应用于研究食管癌的发生和发展过程、病原微生物诱发食管癌恶性演进的分子机制以及高通量的药物疗效筛选等，具有广阔的应用前景。