HPLC法同时测定五加生化胶囊中6种有效成分含量

庄 岩，任晓磊，姚 琳，王伟明，何 翔

(1黑龙江省中医药科学院中药研究所·黑龙江 哈尔滨 150036；2多多药业有限公司·黑龙江 佳木斯 154007)

五加生化胶囊是在名方《竹林寺女科》生化汤的基础上加味而得，全方由当归、川芎、刺五加、桃仁、干姜及甘草6 味中药组成[1]，具有活血散瘀、补气补血、温经止痛之效，用于产后及流产后的阴道出血时间长、出血量多及产后宫缩痛、流产后腹痛、痛经等病症的治疗[2-8]。

紫丁香苷和刺五加E是刺五加的主要成分。紫丁香苷具有增强机体免疫力、改善心肌缺血、抗氧化的作用[9]；刺五加苷E能够调控(抗)炎症因子的表达，增强机体免疫功能[10]。绿原酸是刺五加、川芎、当归共有的有效成分，具有抗菌、抗氧化、免疫调节等多种作用，并且能够作为抗凝剂，改善血小板的聚集[11]。洋川芎内酯A和藁本内酯是川芎和当归的共有成分，藁本内酯具有与镇痛抗炎的作用[12]；洋川芎内酯A在抗炎镇痛、舒张血管、抗血小板聚集、抗氧化等方面有着显著功效[13]。甘草酸铵是甘草的有效成分之一，具有抗炎的功效，能够有效抑制小鼠由醋酸或棉球诱发的急慢性炎症[14]。

目前五加生化胶囊的质量控制标准主要参照《中国药典》对紫丁香苷、刺五加苷E、异嗪皮啶的含量测定，指标较少，不能全面地对五加生化胶囊质量进行控制。为了更好地把控制剂质量，尤其是把控当归、川芎、刺五加等君臣药的质量控制，本文建立了五加生化胶囊6种成分同时测定的HLPC法，旨在为五加生化胶囊现代化生产的质量控制奠定了基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1100型高效液相色谱仪：美国Agilent公司；BSA224S-CW 四位天平：德国赛多利斯公司；Sartorius BP211D五位天平：德国赛多利斯公司；KQ-300DB型数控超声仪：昆山市超声仪器有限公司；ATC2-5-U超纯水机：美国艾科浦国际有限公司。

1.2 药品 五加生化胶囊(批号：2003151、1812231、1904221、1905121、1906151、1906291、1905101、1905061、1907061、1812261、1908101)共10 批次，均由多多药业有限公司提供。紫丁香苷(批号：A-002-181216)、绿原酸(批号：L-007-150730)、刺五加苷E(批号：K-003-150730)、甘草酸铵(批号：G-003-140728)、藁本内酯(批号：RFS-G01001909016)、洋川芎内酯A(编号：RFS-Y08301903021)：均购自成都瑞芬思生物科技有限公司，仅供含量测定使用，纯度大于等于98%。

1.3 试剂 甲醇(分析级)：西陇科学股份有限公司；甲醇(色谱级)：MERCK公司，德国；屈臣氏蒸馏水：广州屈臣氏食品饮料有限公司；磷酸(色谱纯)：天津市光复精细化工研究所。

2 实验方法

2.1 供试品溶液制备 精密称取五加生化胶囊内容物约0.2 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，摇匀，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，即得供试品溶液。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取紫丁香苷、绿原酸、刺五加苷E、甘草酸铵、洋川芎内酯A、藁本内酯对照品适量，置于容量瓶中，加50%甲醇制成浓度分别为0.03、0.03、0.02、0.03、0.01、0.02 g·L-1的对照品溶液。

2.3 阴性样品溶液的制备 取除川芎、当归外的各单味药材按工艺进行煎煮制得相应阴性样品粉末，取除甘草、川芎、当归外的各单味药材按工艺进行煎煮制得相应阴性样品粉末，取除刺五加外的各单味药材按工艺进行煎煮制得相应阴性样品粉末；按“2.1”项下方法精密称取各阴性粉末0.2 g制备成阴性样品溶液。

2.4 色谱条件 Kromasil 100-5C18 色谱柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)；流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸-水溶液(B)梯度洗脱(0～20 min，10%～20%A；20～30 min，20%～25%A；30～0 min，25%～65%A)；流速1 mL·min-1；柱温30 ℃；检测波长220 nm和254 nm；进样量10 μL。

2.5 线性关系考察 精密称取各对照品适量，加50%甲醇，分别配制成每1 mL含紫丁香苷61.2 μg、绿原酸60 μg、刺五加苷E35.04 μg、甘草酸铵60.50 μg、洋川芎内酯A21.78 μg、藁本内酯31.64 μg的对照品贮备液，加入50%甲醇将贮备液稀释成不同浓度得对照品溶液，在“2.2”项条件下进样，纵坐标为峰面积(Y)，横坐标为进样浓度(X)进行线性回归，得紫丁香苷，绿原酸，刺五加苷E，甘草酸铵、洋川芎内酯A、藁本内酯的线性回归方程，见表1。

表1 各成分线性回归方程

2.6 精密度试验 分别精密吸取“2.2”项下制备的各对照品溶液，分别在“2.4”项色谱条件下连续进样6次，进样体积10 μL。分别对6个色谱峰得峰面积得RSD值进行计算，结果表明6个对照品色谱峰面积的RSD均小于2.0%，表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验 取五加生化胶囊内容物按“2.1”项下制备的同一份供试品溶液，分别于制备后的 0、2、4、6、8、12 h 进样，共记录6个时间点的图谱。结果显示色谱峰面积的RSD均小于2.0%。表明供试品溶液在室温条件下12 h内稳定性良好。

2.8 重复性试验 精密称取五加生化胶囊内容物，按“2. 1”项下供试品溶液制备方法平行制备6份供试品溶液，依法测定6个指标的含有量RSD值均小于2.0%。结果表明该方法重复性良好。

2.9 加样回收试验 精密称取“2.1”项已测知含量样品约0.2 g，分别加入一定量相应对照品，按照“2.1”项下方法制备供试品溶液，进样10 μL进行测定，结果紫丁香苷、绿原酸、刺五加苷E、甘草酸铵、洋川芎内酯A、藁本内酯的回收率分别为103.66%、99.23%、100.03%、104.66%、97.46%、98.52%，RSD分别为0.58%、0.49%、0.18%、0.76%、1.32%、1.70%。见表2。

表2 五加生化胶囊样品加样回收率考察结果

续表2 五加生化胶囊样品加样回收率考察结果

3 样品含量测定

五加生化胶囊内容物粉末按“2.1”项下的制备方法进行供试品溶液制备，按“2.4”项下色谱条件进样测定，通过外标法计算待测成分含有量，见表2。结果表明紫丁香苷、绿原酸、刺五加苷E、甘草酸铵、藁本内酯、洋川芎内酯A的含量范围分别为2.8～4.0 mg·g-1、2.5～3.1 mg·g-1、1.3～1.6 mg·g-1、1.6～2.4 mg·g-1、0.9～1.3 mg·g-1、1.1～1.6 mg·g-1。见表3。

表3 五加生化胶囊6种成分含量测定结果(mg·g-1)

4 专属性的考察

各测定成分色谱峰的专属性考察结果见图1(A～Y5)。检测结果显示各成分间无干扰，该方法专属性强。

图1 HPLC色谱图(1.紫丁香苷；2.绿原酸；3.刺五加苷E；4.甘草酸铵；5.洋川芎内酯A；6.藁本内酯)

5 讨论

在方法的建立过程中，分别对流动相、检测波长及柱温进行了考察，结果以0.1%甲酸溶液-乙腈、0.1%醋酸溶液-乙腈、0.1%磷酸溶液-乙腈、0.1%磷酸溶液-甲醇4种流动相系统分别进行考察，其中，0.1%磷酸溶液-乙腈分离效果最好。对220、254、280、320 nm4种检测波长进行考察发现：在320 nm波长下，仅有绿原酸和藁本内酯；280 nm个别色谱峰分离度较低，且峰面积较小；波长在220、254 nm下各峰比例良好，峰与峰间距良好，易于分辨；因此确定检测波长为220、254 nm。为保持色谱分析的一致性，故设定柱温来控制不同实验环境下的色谱分析，分别对柱温在25、30、35 ℃的分离情况进行考察，结果显示，柱温在30 ℃时的分离情况好。

续图1 HPLC色谱图(1.紫丁香苷；2.绿原酸；3.刺五加苷E；4.甘草酸铵；5.洋川芎内酯A；6.藁本内酯)

本实验对6个指标性成分进行含量测定并确定了成分的归属，其中紫丁香苷、刺五加苷E归属于五加生化胶囊中的刺五加药材，甘草酸铵归属于五加生化胶囊中的甘草药材，洋川芎内酯A、藁本内酯归属于五加生化胶囊中当归和川芎药材。绿原酸归属于五加生化胶囊中甘草、当归和川芎药材。运用高效液相色谱技术对中药复方进行测定，同时建立多个指标的测定，对有效成分进行更全面的质量把控[15-19]。本实验中对紫丁香苷、绿原酸、刺五加苷E、甘草酸铵、洋川芎内酯A、藁本内酯等主要成分进行含量测定，并且建立五加生化胶囊6个成分含量的HLPC法同时测定法。方法简便，为五加生化胶囊质量标准的提高提供参考。