猪链球菌细菌素的筛选及理化特性分析

王凌利，杨 亲，祝 瑶，杨文琳，曹 俊，刘思国，张万江

（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病创新团队，黑龙江 哈尔滨 150069）

猪链球菌（Streptococcus suis，SS）是世界范围内影响猪健康的重要病原菌之一，可以引起猪严重的感染性疾病，如脑膜炎、败血症和心内膜炎等，给养猪业造成了重大的经济损失[1]。目前，用抗菌药预防和治疗该病是最有效的手段。然而，由于抗菌药在畜牧业的大量和不合理使用，导致了细菌耐药性的出现和快速传播。因此，有必要开发可在临床环境中使用的新型抗菌素。细菌素是由细菌核糖体产生的在体内和体外均具有抑菌活性的生物活性肽，它们在体内经过不同酶的加工后产生活性，被释放到细胞外，对其他微生物进行杀伤作用[2-3]。与抗生素相比，细菌素具有高效、无毒、无残留、无耐药性等优点，是一种有价值的控制细菌感染的抗菌制剂，有望解决抗生素耐药性传播的问题和代替抗生素并在畜牧业中应用的一类理想替代品。羊毛硫细菌素（Lantibiotics）是在革兰阳性细菌的核糖体中合成的一类作用于细胞膜上的热稳定小分子抗菌肽，分子量小于5 ku，其特点是有翻译后修饰的过程[4]。本研究利用琼脂扩散法筛选产抑菌物质的SS，用PCR 方法进一步检测细菌素相关基因，并对筛选的SS 菌株的粗提取物检测了其理化性质，为进一步研究SS 细菌素奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料200 株SS（包含G-9）、SS BAA、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 29213、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）T33、无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）JH2-2、大肠杆菌（Escherichia coli）ATCC 25922、沙 门 氏 菌（Salmonella）SL1344、巴 氏 杆 菌（Pasteurella）284-1 均由本实验室保存；THB 培养基和琼脂购自BD 公司；MRS 培养基购自北京路桥技术有限公司；玛琳乙磺酸（MES）购自上海源叶生物科技有限公司；硫酸铵购自国药集团化学试剂有限公司；PCR 试剂购自TaKaRa 公司；过氧化氢酶、蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶购自上海源叶生物科技有限公司；细菌基因组DNA 提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 引物设计与合成根据GenBank 登录的3 个基因簇序列（KU867866.1、KU867867.1、KU867868.1）设计SS 细菌素相关基因扩增引物，分别为sslA-F/R、suiA-F/R和sss-F/R；根据GenBank登录号KU867868.1的基因序列，设计suicin 65 基因簇的分段扩增引物sxj-1-F/R～sxj-8-F/R（表1）。引物均由吉林库美生物科技有限公司合成。

表1 PCR引物序列Table 1 Primers used in this study

1.3 产抑菌物质SS 的筛选采用琼脂扩散法筛选菌株[5]。将5 μL 200 株SS 株分别接种于THB 固体培养基上，37 ℃培养24 h 后，用7 mL 含有指示菌菌液的软琼脂THB 固体培养基均匀覆盖，37 ℃过夜培养。以SS BAA、金黄色葡萄球菌ATCC 29213 为指示菌，并测量对指示菌的抑菌圈直径。

1.4 产抑菌物质SS 的分型鉴定对筛选出的SS 通过CGE Server 网站进行MLST 分型；根据文献[6-7]设计SS 分型引物，通过PCR 方法鉴定血清型。

1.5 SS 细菌素相关基因的检测文献中已报道的SS 产生的细菌素suicin 主要为3 种，即suicin 90-1330（sslA）[8]、suicin 3908（suiA）[9]和suicin 65（sss）[10]，采用sslA-F/R、suiA-F/R 和sss-F/R 引物（表1），对产细菌素的SS 进行PCR 扩增。

1.6 筛选的SS 菌株全基因组序列功能基因的分析从筛选出的可产生抑菌物质的SS 菌株中选择xj-144 菌株，其基因组由金唯智生物科技有限公司进行二代测序，利用在线软件BAGEL4 分析细菌素潜在的经核糖体途径合成的和翻译后修饰的多肽（RiPPs）的合成基因簇。

1.7 细菌素基因簇的分段扩增及其编码氨基酸的同源性分析以xj-144 菌株基因组为模板，利用引物sxj-1-F/R～sxj-8-F/R（表1）PCR 分段扩增suicin 65的基因簇，PCR 产物由吉林库美生物科技有限公司测序，测序结果通过软件拼接，获得xj-144 菌株潜在细菌素基因簇的完整序列，命名为sxj。利用NCBI Protein blast 网络平台，对比sxj 基因簇与suicin 65基因簇的同源性，对sxj 基因簇的结构基因进行氨基酸序列比对。

1.8 细菌素的粗提及理化特性分析

1.8.1 细菌素的粗提及抑菌物质的检测 将xj-144单菌落接种于THB 培养基中37 ℃过夜培养后转接至500 mL MRS 培养基培养24 h。高速离心后收集上清，缓慢加入硫酸铵固体粉末至终浓度为60%，4 ℃磁力搅拌器搅拌3 h～6 h后，10 000 r/min离心30 min，沉淀复溶于MES（pH5.5）溶液中透析24 h 后得到细菌素的粗提取物。以SS BAA 为指示菌，利用双层琼脂扩散法测定抑菌物质活性[11]，取15 mL THB 固体培养基倒入平板中，冷却凝固后，均匀放置牛津杯，利用15 mL 含有指示菌菌液的软琼脂THB 固体培养基均匀覆盖，冷却凝固后将牛津杯取出，取150 μL 的粗提取物放入孔中，37 ℃过夜培养。

1.8.2 细菌素酸排除试验 为排除有机酸对粗提取物抑菌活性的干扰，将粗提取液pH 调至7.0，并用乙酸调节MRS 培养基的pH 值为5.5 作为对照，然后利用双层琼脂扩散法检测细菌素粗提物的抑菌活性。

1.8.3 细菌素的过氧化氢排除试验 为排除过氧化氢对粗提取物抑菌活性的干扰，将粗提取液的pH 值调至7.0，加入终浓度为500 μg/mL 的过氧化氢酶，37 ℃孵育1 h 后65 ℃5 min 使酶失活，利用双层琼脂扩散法检测细菌素粗提物的抑菌活性。

1.8.4 蛋白酶稳定性的检测 为检测粗提取液对酶的敏感性，将粗提取液的pH 值调至7.0，按照终浓度500 μg/mL 分别加入胰蛋白酶、胃蛋白酶，蛋白酶K，37 ℃孵育1 h 后65 ℃5 min 使酶失活，利用双层琼脂扩散法检测细菌素粗提物的抑菌活性。

1.8.5 酸碱耐受性的检测 取10 mL 粗提取物，利用HCl 和NaOH 调节粗提取液的pH 分别为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 和12 后，利用双层琼脂扩散法检测抑菌活性并测量抑菌圈直径。

1.8.6 耐热性的检测 取少量粗提取物，在45 ℃、70 ℃、100 ℃和121 ℃下处理15 min，另外分别在4 ℃和室温放置1 周后，利用双层琼脂扩散法检测抑菌活性并测量抑菌圈直径。

1.9 细菌素抑菌谱的测定以部分革兰阳性菌：SS G-9、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、无乳链球菌、粪肠球菌；部分革兰阴性菌：大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌为指示菌，利用双层琼脂扩散法检测细菌素粗提物对上述各菌的抑菌活性，确定细菌素的抑菌谱。

2 结 果

2.1 产抑菌物质SS 的筛选结果200 株SS 经琼脂扩散试验，结果显示共筛选出了21 株对SS2 BAA 和金黄色葡萄球菌ATCC 29213 均具有明显抑菌作用的菌株，对2 种指示菌的抑菌圈直径见图1。表明这21株SS 可以产生某种对SS2 BAA 和金黄色葡萄球菌有明显抑菌作用的物质。

图1 21株SS对BAA（A）及对ATCC 29213（B）抑菌圈直径的统计Fig.1 The inhibition zone diameters of 21 SS strains to BAA(A)and ATCC 29213(B)

2.2 产抑菌物质SS 的分型试验结果对筛选出的21 株SS 通 过CGE Server 网站进行MLST 分型，通过PCR方法进行血清学分型，结果显示21株产抑菌物质的SS 分布于多个ST 型和血清型：ST 型ST28 为8 株，ST308 为1 株，ST485 为2 株，ST941 为1 株，ST1259为3株，ST1263为4株，ST1265为1株；血清型4型2株，NCL-7型5株，8型1株，9型8株，12型1株，30型2株，未分型2株（表2）。表明产生抑菌物质的SS分布于多个血清型。

表2 21株产抑菌物质SS的血清型Table 2 Serotypes of 21 SS strains producing bacteriostatic substances

2.3 SS 细菌素相关基因检测结果以筛选出的21株产抑菌物质SS 的基因组为模板，用引物sslA-F/R、suiA-F/R 和sss-F/R 进行PCR 扩增，结果显示21株SS 中，菌株xj-144 携带sss基因，菌株38-3 携带suiA基因，其余菌株并未检测出SS 细菌素相关基因（图2）。表明菌株xj-144 和38-3 产生的抑菌物质与SS 细菌素相关。

图2 xj-144（A）和38-3（B）菌株细菌素相关基因的PCR扩增Fig.2 PCR amplification of bacteriocin-related genes in xj-144(A)and 38-3(B)strains

2.4 筛选的SS 全基因组序列功能基因分析结果菌株xj-144 与38-3 携带了与SS 细菌素相关的基因，由2.1 结果可知，菌株xj-144 比菌株38-3 的抑菌效果好，因此选用菌株xj-144 进行后续试验。菌株xj-144 经金唯智公司二代测序，并通过在线软件BAGEL4 对菌株xj-144 的全基因组序列功能基因分析可能产生的细菌素或RiPPs，结果发现菌株xj-144 的代谢产物中潜在的热点区域（Areas of interest，AOI）仅有一个（图3A），且xj-144 共有3 个核心肽（Core peptide），其编码的氨基酸序列分别与suicin 65 基因簇中的sssA、sssA'、sssA1编码的氨基酸序列相同（图3B）。表明菌株xj-144 中仅有1 个与suicin 65 核心肽相同的细菌素，并没有其他潜在细菌素的存在。

图3 xj-144全基因组序列功能基因分析结果Fig.3 Results of functional gene analysis results of xj-144 whole genome sequence

2.5 xj-144 菌株基因簇功能分析结果以xj-144 菌株的基因组为模板，利用sxj-1-F/R～sxj-8-F/R引物分段扩增，得到了菌株xj-144 完整的基因簇（图4A）。利用NCBI 比对，结果显示菌株xj-144 基因簇与suicin 65 的同源性为99.4%。xj-144 菌株潜在的细菌素相关基因簇（sxj）长11 000 bp，包含10 个ORFs。该基因簇编码了细菌素的结构基因（sxjA、sxjA'、sxjA1）（图4B），氨基酸比对结果显示sxjA 与sxjA'的相似性为92.16%，与sxjA1 的相似性为51.06%；此外还有参与修饰的合成酶（sxjM）、ABC 转运蛋白（sxjT）、反应调节蛋白（sxjR）、双组份调控蛋白（sxj-R、sxjK）和3 种免疫蛋白（sxjE、sxjF、sxjG）。该结果表明xj-144 与suicin 65 有相同的基因簇，属于suicin 家族，其基因的10 个ORFs 共同参与了细菌素的合成、免疫和调节过程。

图4 sxj基因簇功能分析Fig.4 Functional analysis of sxj gene cluster

2.6 细菌素粗提取液的理化特性分析结果利用硫酸铵沉淀的方法得到粗提取液，经过不同的方式处理后利用双层琼脂扩散法检测其抑菌活性，对指示菌BAA 的抑菌结果显示：经乙酸调节为pH7.0 后的粗提液对BAA 仍有抑菌效果，而pH5.5 的培养液对照没有抑菌圈产生；经过氧化氢酶处理后的粗提取液对BAA 仍然有抑菌作用，可以排除有机酸和过氧化氢对细菌素抑菌作用的影响（图5A）。粗提取液经蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶处理后，依然有抑菌活性，表明细菌素对蛋白酶有稳定性（图5B）；经不同pH处理后，粗提取液仍保持抑菌活性（图5C），表明细菌素有较强的酸碱耐受性；经不同温度处理后，粗提取液保持抑菌活性（图5D），表明细菌素有一定的耐热性。

图5 xj-144菌株细菌素的理化特性分析Fig.5 Analysis of physical and chemical properties of bacteriocin produced by strain xj-144

2.7 细菌素抑菌活性谱的测定结果利用不同的革兰阳性菌和革兰阴性菌作为指示菌，检测菌株xj-144 粗提取液的抑菌活性谱（表3）。结果显示，其产生的细菌素不仅对猪链球菌，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、无乳链球菌等革兰阳性菌有抑菌作用，对革兰阴性菌巴氏杆菌也有抑制作用。表明菌株xj-144 产生的细菌素抑菌谱广泛。

表3 细菌素的抑菌活性谱Table 3 Antibacterial activity spectrum of bacteriocin produced by strain xj-144

3 讨 论

随着耐抗生素细菌的出现，研发新的抗菌药物日益受到人们的广泛关注。细菌素是一种经核糖体合成的细菌源抗菌肽，是治疗细菌感染性疾病的一种有希望的替代药物。细菌素具有很强的热稳定性，并且对强酸强碱、表面活性剂和高盐等环境因子具有较强的耐受力；这些特性使该细菌素具有潜在的广阔应用前景。在不同类型的羊毛硫细菌素中，乳酸链球菌肽是报道最多、研究最深入的细菌素，目前已经有60 多个国家和地区使用乳链菌肽作为防腐剂，已有报道证实乳链菌肽可以抑制耐甲氧苄啶的金黄色葡萄球菌等细菌的生长[12]。Melancon 和Grenier 首先报道了SS 分离株可以产生与有机酸和过氧化氢无关的抑制物质，并表现出与羊毛硫细菌素相关的特性[13]。根据报道，从2 型SS 的ST25 和ST28中发现了3 种不同的羊毛硫细菌素，suicin 90-1330（sslA）是由ST28 非毒性SS 分离的AI 型羊毛硫细菌素；suicin 3908（suiA）是2 型SS 产生的一种AII 型羊毛硫细菌素；suicin 65（sss）是由ST28 非毒性SS 产生的第二种AII 型羊毛硫细菌素。

在本研究中，筛选了近年来从不同地区健康猪肺脏样品中分离纯化的200 株SS，获得21 株可产生抑菌物质的菌株，其代谢产物有明显的抑菌活性，其中携带细菌素相关基因的占比约为9.52%，PCR 鉴定出了菌株38-3 和xj-144 分别携带suiA和sss细菌素相关基因，没有扩增到sslA基因，38-3 和xj-144 为4型SS，说明不仅2 型SS 可以产生suicin，其他血清型也会产生。其他菌株并未鉴定出来与SS 细菌素相关基因，可能存在未知的与抑菌作用相关的基因或物质。使用在线软件BAGEL4 检索菌株xj-144 全基因组中细菌素潜在的经核糖体途径合成的和翻译后修饰的多肽（RiPPs）的合成基因簇，显示其仅有一个潜在的AOI，与suicin 65 的核心肽相同，并没有其他细菌素。与细菌素合成相关的基因通常以基因簇的形式出现，包含了结构基因、免疫基因和修饰酶以及运输酶的相关基因，每个ORF 均起到不同的作用。本实验发现，菌株xj-144 的粗提取物在排除有机酸和过氧化氢潜在影响因素后，其仍具有耐高温、酸碱耐受性和蛋白酶稳定性，符合细菌素的稳定特性，这个特性使其可以更好的应用于临床抗感染的治疗和作为饲料添加剂。羊毛硫细菌素被认为普遍对革兰阳性菌有抑菌作用，菌株xj-144产生的抑菌物质对许多革兰阳性菌具有明显的抑菌效果，同时对革兰阴性菌巴氏杆菌也有抑菌作用，这对获得新型且较广谱的代替抗生素的抑菌物质十分重要，但不排除菌株中还有未知的物质在起作用。

筛选出产生细菌素的菌株对控制SS 和其他细菌病具有重要作用，可减少养猪业中抗生素的使用，从而解决抗生素耐药性的传播问题，该策略为以后使用细菌素代替抗生素奠定了基础。