miR-101基因簇与食管癌发病风险的病例对照研究

王 婷，张雯雯，张永欣，曾 勇，王俊玲，李成云

(兰州大学公共卫生学院卫生毒理学研究所，甘肃 兰州 730000)

微小RNA(microRNA，miRNA)是一类内源性非编码小RNA，长度为21～25 个核苷酸，广泛存在于真核生物体内，是一类重要的高度保守的非编码小分子单链RNA，具有调节基因表达活性的功能[1]。大量研究证实miRNA异常表达可能导致肿瘤的发生，并影响其发展和预后[2-3]。Hou 等[4]研究发现miRNA 与食管癌的发生相关，可作为潜在的肿瘤诊断或预后判定标志。

已有研究发现，由两个或多个相关的miRNA基因组成的miRNA 基因簇(miRNA cluster)总是以多顺反子转录并具有相似的表达模式[5]，作用共同的靶基因或同一信号通路中的蛋白分子，从而多层次地监控该信号转导途径。这种多靶点调控比单个miRNA的作用模式更复杂，功能更高效[6]。而目前关于miRNA 与食管癌的研究多局限于单一或成熟的miRNA。因此，对miRNA基因簇的深入研究有助于更好的探索食管癌发生发展的分子调控机制[7]。

本研究采用高通量芯片测序技术对食管癌患者癌组织及癌旁组织差异表达的miRNAs 表达谱进行分析。基于低表达较为显著的miR-101-3p，据miRbase数据库(http://www.mirbase.org/)显示：miR-101基因簇由has-miR-101-3p、has-miR125a-5p、has-miR-127-5p与has-miR-145-5p 基因共同组成。目前，对于miR-101 基因簇有研究报道has-miR-101-3p 和has-miR-1455p 在食管癌组织中呈现低表达且发挥竞争内源性RNA功能，可影响靶基因功能，调控食管癌发生发展进程，但确切功能机制仍不明确；has-miR125a-5p和has-miR-127-5p 在食管癌调控方面的研究尚未见报道。因此，本研究旨在通过检测miR-101基因簇编码的各miRNA在食管癌和癌旁组织中的表达水平，进而分析该基因簇的表达与食管癌发病风险的关系，拟为后续miR-101基因簇在食管癌进程中的调控机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 标本收集与microRNA芯片高通量检测

收集并选取甘肃省武威肿瘤医院2019—2020年收治的食管癌进展期3 例患者(男性2 例，女性1 例)癌组织及其癌旁组织(距癌组织边缘大于5 cm)新鲜标本进行组织芯片高通量microRNA 检测；另收集33 例食管癌患者(男性28 例，女性5 例)癌组织及其癌旁新鲜组织标本进行实时荧光定量PCR(real time fluorescence quantitative PCR，qPCR)检测。所有食管癌患者术前均未接受放化疗及免疫治疗，对所采集的全部组织标本进行病理组织形态学检查，病理检查采用常规HE染色，并由2 位专职病理医师完成，食管癌组织标本镜检肿瘤组织大于80%，癌旁对照组织镜检均未发现肿瘤组织。将采集的组织样品(约0.5 cm3)浸入RNAlater 中，并在-80 ℃下储存备用。人群生物样本收集通过甘肃省兰州大学公共卫生学院伦理委员会的审查(伦理审查编号为LZUGWLL-180301)。

1.2 TCGA数据库原始数据下载及分析

选取截止日期为2020年11月1日，进入肿瘤基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)数据库(https://portal.gdc.cancer.gov/) 食管癌(esophageal carcinoma，ESCA)页面，以miRNAseq 数据集所收录的162 例食管癌组织样本和11例癌旁对照组织样本的测序数据作为本研究对象。miRNA 数据选level 3 级别，RNAseq 选项中勾选rsem.genes.normalized_results.txt 文件，在miRNAseq 选项中勾选miRNA.quantification.txt 文件，确定并开始下载。将样本分组编号并审核是否有完整的转录组Illumina Seq System microRNA(Illumina Inc.，Hayward，CA，USA)测序数据。数据的下载和使用均经TCGA 数据库授权，原始测序结果可用于后续分析使用和公开发表。

1.3 主要试剂和设备

组织microRNA 芯片高通量检测(南京金麦普生物科技有限公司)；TRIzol 试剂及RNA-later 购自美国赛默飞世尔科技公司；DEPC 购自美国Sigma-Aldrich 公司；miR-101-3p、miR-125a-5p、miR-127-5p、miR-145-5P和U6基因的qPCR引物购自上海生物工程股份有限公司，相关基因引物序列见表1。逆转录和qPCR试剂盒购自日本TaKaRa 公司。低温高速离心机及水平离心机购自美国Beckman 公司；Real time PCR 扩增仪购自美国Bio-Rad 公司；核酸蛋白测定仪购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

表1 miR-101基因簇相关引物序列

1.4 总RNA提取及qPCR验证

使用TRIzol 试剂，按试剂说明书操作提取组织总RNA，核酸蛋白测定仪NanoDrop2000检测RNA纯度及浓度。使用反转录试剂盒进行miRNA 茎环法逆转录，逆转录条件：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃暂存，将cDNA置于-20 ℃冰箱保存。qPCR反应体系为25.0 μL，包括12.5 μL SYBR Premix Ex Taq Ⅱ、10 μmol/L 上下游引物各1.0 μL、2.0 μL RT 反应液(cDNA)、8.5 μL RNase free dH2O。反应条件为：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，55～65 ℃、30 s，40 个循环。U6为内参，每个实验样本设置3个复孔，检测重复3 次。qPCR 判断基因高低表达水平采用2-ΔΔCT法，2-ΔΔCT值>1时判断为高表达，2-ΔΔCT值<1判断为低表达。

1.5 统计分析

应用SPSS 26.0 软件进行统计分析，结果以表示。配对t检验分析miR-101 基因簇在食管癌及其癌旁组织中的表达，以α=0.05为检验水准。Logistic回归分析miR-101基因簇与食管癌发病风险的关系。采用受试者特征曲线(receiver operator characteristics curve，ROC)评价miR-101 基因簇对食管癌的诊断效力，通过计算曲线下面积(area under curve，AUC)来判断诊断价值，Fisher 检验分析基因簇各miRNA 的表达和食管癌患者临床病理指标之间的相关性。

2 结果

2.1 食管癌相关差异化表达的miRNA 筛选及miR-101基因簇表达水平TCGA数据库验证

对3 例新发食管鳞癌患者的食管癌组织及其癌旁组织进行miRNA 芯片高通量检测。结果显示288 种miRNAs在两种组织中表达有差异，其中在食管鳞癌组织中有179种miRNAs表达下调。miR-101基因簇相关基因在食管癌组织中下调倍数(fold change)分别为hasmiR-101-3p(-11.90)、has-miR-125a-5p(-4.76)、hasmiR-127-5p(-4.35)、has-miR-145-5p(-2.17)，见 图1。TCGA数据库验证miR-101基因簇相关基因表达水平，其中TCGA数据库162例食管癌和正常食管组织样本11例测序数据生物信息学分析结果显示，与食管正常组织相比，miR-101-3p、miR-125a-5p和miR-145-5p在食管癌组织中表达均显著下调(P<0.05)，见图2。

图1 食管癌及其癌旁组织中表达下调的部分miRNAs

图2 TCGA数据库中miR-101基因簇的表达水平

2.2 miR-101基因簇在食管癌患者中的表达水平

应用qPCR检测miR-101基因簇在33例人群食管癌组织及其癌旁组织中的表达，结果显示，miR-101-3p、miR-125a-5p、miR-127-5p和miR-145-5p在食管癌患者癌组织中均呈低表达(P<0.05)，见表2。结果与芯片高通量测序及TCGA数据库生物信息学分析相符。

2.3 miR-101基因簇与食管癌发病风险的分析

Logistic 回归分析食管癌组织与癌旁组织中miR-101 基因簇各miRNA 的△CT值与食管癌发病风险之间的相关性，见表3。多因素logistic 回归分析结果提示，miR-101-3p、miR-127-5p和miR-145-5p的表达水平与食管癌的发病风险呈负相关，增加其表达可以显著降低食管癌的发病风险(均为P<0.05)。

表3 miR-101基因簇表达与食管癌发病相关性的logistic回归分析(n=33)

2.4 miR-101基因簇对食管癌的诊断效力

采用ROC特征曲线法评价miR-101基因簇对食管癌的诊断效力，并通过计算AUC来确定食管癌的诊断价值。结果显示，miR-101-3p、miR-125a-5p、miR-127-5p 和miR-145-5p 诊断的AUC 分别为0.753、0.792、0.763 和0.800(P<0.05)，提示miR-101 基因簇在食管癌的诊断中具有一定诊断效力(图3)。

图3 miR-101基因簇对食管癌的诊断效力

2.5 miR-101 基因簇的表达与食管癌临床病理指标的相关性分析

对miR-101基因簇中4个基因的表达水平与33例食管癌患者的临床病理资料进行相关性分析。结果表明，miR-101-3p、miR-145-5p 的表达水平与肿瘤大小相关(P<0.05)，miR-125a-5p的表达水平与是否存在淋巴结转移相关(P<0.05)，其他指标之间差异均无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 miR-101基因簇表达水平与33例食管癌患者临床病理指标的相关性分析

3 讨论

食管癌作为恶性程度较高的消化道肿瘤之一，其病理类型中90%属食管鳞状细胞癌，中晚期的食管癌预后差且死亡率高[8]。目前，食管癌诊断主要依赖于内镜活检后的病理形态学观察，但其漏诊率大于30%[9]，在实验室诊断方面尚缺乏特异性分子诊断标志物。探寻能够准确反映食管癌癌变机制并能应用于食管癌高危人群早期诊断的生物标志是当前食管癌防治的重点。因此，本研究在食管癌芯片高通量检测的基础上，应用TCGA数据挖掘比对以及qPCR验证的方式研究了miR-101基因簇与食管癌发病风险的关联及其作为食管癌诊断生物标志物的可能性。

miRNA基因簇是由两个或多个相关的miRNA基因组成，并在染色体上成簇排列形成的基因群，这些基因可通过综合调控编码基因并在多个层面上参与个体发育、代谢过程和疾病发生的调控[10]，可作为潜在的综合性肿瘤诊断或预后判定标志。研究发现，与正常食管黏膜上皮组织比较，食管癌组织呈现不同的miRNA 表达模式[11]，其异常表达可为食管癌诊断和预后生物标志的探寻提供新的方向。

miR-101 具有两个前体发夹结构，在人类中分别在1 号和9 号染色体转录而成，其临近位置成簇排列miR-101-3p、miR-125a-5p、miR-127-5p 和miR-145-5p。其中，miR-101-3p在食管癌[12]、肝癌[13]和子宫内膜癌[14]中呈低表达，发挥类似抑癌基因的作用。miR-125a-5p 在食管癌[15]和膀胱癌[16]细胞中呈低表达，发挥抑癌基因的作用。miR-127-5p 和miR-145-5p 在食管癌[17-18]、胃癌[19-20]和结肠癌[21]中呈低表达，也发挥抑癌基因的作用。为进一步研究miR-101基因簇的表达与食管癌之间的关系，确认芯片结果的准确性，本研究检测了miR-101基因簇在33例食管癌及癌旁组织的表达水平。结果显示miR-101-3p、miR-125a-5p、miR-127-5p 和miR-145-5p 在食管癌组织中表达均为低表达，结果与TCGA数据库结果相一致(miR-127-5p除外)。

同时，我们分析了miR-101基因簇与食管癌发病风险之间的关系，发现增加miR-101基因簇的表达可以降低食管癌的发病风险，临床病理相关性分析结果提示miR-101-3p、miR-145-5p 的表达水平与食管癌患者肿瘤大小相关，miR-125a-5p 的表达水平与淋巴结转移相关。表明miR-101-3p、miR-145-5p和miR-125a-5p 参与了食管癌的发生和发展，在食管癌进程中可能发挥重要功能，提示其可作为食管癌的潜在生物标志物。但本研究样本的收集时间为1 年，所获得的样本量较小，可能不能完全代表整体水平。本研究33 例样本中发现miR-127-5p 在食管癌患者癌组织中呈低表达与TCGA 数据库结果不完全一致，这可能与样本量较小有关，在接下来工作中我们拟收集更大样本量进行验证。

综上所述，本研究分析和检测了miR-101基因簇在食管癌中的表达情况，miR-101-3p、miR-125a-5p、miR-127-5p和miR-145-5p的表达水平与食管癌的发病风险呈负相关，且miR-101-3p、miR-145-5p和miR-125a-5p的表达与食管癌患者的临床病理因素具有相关性，提示miR-101基因簇在食管癌生物标志研究方面具有深入研究的价值。然而，miR-101 基因簇的各基因是否作为一个整体，参与复杂的分子信号调控网络，共同影响食管癌的发生发展仍不清楚，其调控食管癌的分子机制有待于进一步研究。