17 种绵蟹线粒体COI 基因比较及系统进化分析

韦丽明，张 莹，吕振明，龚 理，苗增良

(浙江海洋大学海洋科学与技术学院，海洋生物种质发掘与利用国家地方联合工程实验室，浙江舟山 316022)

绵蟹，隶属甲壳纲Crustacea、十足目Decapoda、短尾派Brachyura、绵蟹总科Dromioidea、绵蟹科Dromiidae[1]；生活于8～150 m 水深的泥底或泥沙底海区，我国广东、海南、台湾、福建等地均有分布。绵蟹科种类丰富，根据WoRMS 网站记载(http：//www.marinespecies.org/aphia.php?p=taxdetails&id=106742&allchildren=1)，目前该科包括3 亚科49 属共306 种。当前大多数研究聚焦于绵蟹的生态习性和形态结构等方面[2-4]，而较少关注该科种类在分子水平上的差异及种间亲缘关系[3]。

基于形态学特征的传统分类方法具有直观、便捷等优点，但也容易受到环境因素和主观因素的干扰，尤其是针对卵和仔稚生物样品以及样品破损等情况，仅依靠形态学特征有时也不能准确地进行物种鉴定[5-9]。随着分子生物学的迅猛发展，DNA 条形码(DNA barcoding)技术作为形态学辅助方法在分类学及群体遗传学等领域应用越来越广泛[6,10-11]。DNA 条形码利用的是生物体内能够代表该物种唯一的、相对较短且易扩增的一个或一些DNA 片段，能客观准确区分不同物种[12]。目前应用最广泛的DNA 条形码是线粒体细胞色素C 氧化酶亚基I(Cytochrome c oxidase subunit I,COI)序列，截至2022 年4 月国际生命条形码计划(iBOL)数据库中已有约1057 万条DNA 条形码。

自2003 年HEBERT,et al[13]首次提出DNA 条形码概念以来，该技术从低等的真菌、藻类和无脊椎动物到高等的两爬类、鱼类和哺乳类都被证明在分类鉴定中是行之有效的[14-18]。例如：ORTMAN,et al[19]应用COI基因序列分析了1 种立方水母、10 种钵水母和84 种水螅水母的遗传距离，证实了条形码间隔的存在，并提出COI可作为水母亚门种类鉴定的分子标记；徐岩等[20]基于COI基因序列对中国沿海相手蟹Sesarmidae进行分子系统发育分析，结果表明相手蟹为多系起源，且日本的无齿螳臂相手蟹Chiromantes dehaani与长江口的无齿螳臂相手蟹C.neglectum虽然在形态上存在一定差异，但分子数据显示两者为同种异名；苗宪广等[21]基于COI基因序列对28 种鲽形目Pleuronectiformes 舌鳎亚科Cynoglossinae 鱼类进行系统发育研究，发现所有舌鳎亚科鱼类形成一个单系群，并与无线鳎亚科Symphurinae 鱼类形成稳定的姐妹群关系；此外，遗传距离结果还支持紫斑舌鳎Cynoglossus purpureomaculatus和长吻红舌鳎C.lighti分别与短吻三线舌鳎C.abbreviatus和短吻红舌鳎C.joyneri互为同物异名关系。

本研究测定了德汉劳绵蟹Lauridromia dehaani和阿特拉斯平壳蟹Conchoecetes atlas的线粒体COI基因序列，结合GenBank 数据库中已经公布的15 种绵蟹科COI基因部分序列，对这17 种绵蟹科种类的线粒体COI基因序列特征进行了比较分析，并基于这些COI序列构建了目前为止最全面的绵蟹科系统发育树，以期探讨COI序列在绵蟹物种鉴定中的适用性及绵蟹科物种之间的亲缘关系，为保护绵蟹物种多样性及短尾派系统发育的研究提供分子数据。

1 材料与方法

1.1 样品采集及基因组提取

2019 年11 月于浙江舟山采集绵蟹样品，将新鲜的绵蟹样品用95%酒精保存，运输至实验室进行形态学鉴定，样品鉴定参考《中国海洋蟹类》[1]和《中国动物志短尾次目海洋低等蟹类》等[22-23]。分别取绵蟹肌肉组织约30 mg 剪碎后置于离心管中，利用盐析法提取绵蟹的基因组DNA，用紫外分光光度计检测DNA 质量与浓度，并稀释为50 ng·μL-1，置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.2 引物设计与PCR 扩增

根据短尾次目线粒体COI基因的保守区域设计通用引物F1-COI：TCNACAAAYCATAAAGAYATYGG/R1-COI：TANACYTCWGGRTGHCCRAARAAYCA。PCR 扩增反应总体积为33 μL，包括正引物和反引物各1.5 μL，模板1.5 μL，Mix 酶15.0 μL，灭菌双蒸水ddH2O 13.5 μL。扩增程序为先经过95 ℃预变性3 min 后，95 ℃变性30 s，48～54 ℃退火50 s，68 ℃延伸1 min，共进行35 个循环结束后再进行68 ℃继续延伸10 min。通过1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 扩增产物，将目的片段的PCR 纯化产物送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序。

1.3 序列注释及分析

使用Sequin 软件(version 15.10,http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Sequin/)对本研究中测定的2 种绵蟹线粒体COI基因片段序列进行注释；从GenBank 数据库中下载目前所有15 种绵蟹科种类线粒体COI基因序列，利用软件Clustal X 2.0[24]对这些序列进行比对，使用MEGA X[25]计算它们的碱基组成、保守位点和遗传距离，利用软件MatGAT 2.02[26]进行多序列相似性比较分析。

1.4 系统进化树构建

为了探究本研究测定的2 种绵蟹及GenBank 数据库中15 种绵蟹共17 种绵蟹物种之间的亲缘关系，本研究以相手蟹科Sesarmidae 的无齿螳臂相手蟹C.dehaani和红螯螳臂相手蟹C.haematocheir为外类群，基于上文分析的COI序列利用MEGA X[25]软件同时构建绵蟹科最大似然树(maximum likelihood,ML)和最大简约树(maximum parsimony,MP)，Bootstrap 设置为1 000 次，利用PhyloSuite 构建贝叶斯树(Bayesian inference,BI)。

2 结果与分析

2.1 COI 基因序列比较分析

本研究测定的德汉劳绵蟹和阿特拉斯平壳蟹的线粒体COI基因序列提交至GenBank 数据库中(登录号分别为MZ928448 和MZ873493)。用于比较分析的17 种绵蟹COI序列对应的物种信息如表1 所示。比对序列的长度为495 bp，共连续编码165 个氨基酸，不存在碱基插入或缺失现象。17 种绵蟹的碱基含量略有区别：34.3%～38.0% T、17.0%～22.0% C、26.9%～29.9% A 及15.2%～16.8% G，A+T 含量为61.2%～67.9%，平均含量为64.5%，G+C 含量为32.2%～38.8%，平均含量为35.5%(表1)，A+T 含量明显高于G+C 含量，符合后生动物线粒体基因AT 偏倚性，与其他蟹类COI基因具有相同特点[20,27-28]。通过核苷酸序列比对显示共有340 个保守位点，155 个变异位点(约占32.0%)，其中绝大多数为第三位密码子(130 个变异位点)，而第二位密码子十分保守仅有1 个变异位点，第一位密码子有24 个变异位点(图2a)。而将核苷酸翻译成氨基酸序列后再比对，变异位点数仅3 个，其中2 个为自裔位点(singleton site)，变异位点率仅占1.82%(图2b)，表明当第三位密码子变异并不一定会使氨基酸发生改变。这是由于“遗传密码的简并性”，即第三位密码子具有摇摆性以确保遗传性状的稳定[29]。

图2 17 种绵蟹线粒体COI 基因片段核苷酸(a)及氨基酸序列(b)比对Fig.2 Alignment of nucleotide (a) and amino acid sequence (b) of COI fragment of 17 Dromiidae species

表1 本研究构建系统发育树所用物种信息Tab.1 List of 17 Dromiidae species and two outgroup used in this paper

2.2 遗传距离及相似性分析

从GenBank 数据库中下载了15 种绵蟹的COI序列，结合本研究测定的2 种绵蟹的COI序列，我们对这17 种绵蟹的COI序列相似性及遗传距离进行了分析，结果显示德汉劳绵蟹1 和德汉劳绵蟹4 之间的COI序列相似性最大(99.8%)，遗传距离最小(0.002)；其次为绵蟹科未定种1 和绵蟹科未定种6，序列相似性和遗传距离分别为99.4%和0.006，表明德汉劳绵蟹1 和4 以及绵蟹科未定种1 和6 分别为同一物种。而GenBank 数据库中提交的德汉劳绵蟹(EU636986 和MG742718)与本研究中的德汉劳绵蟹4 的COI序列相似性分别为84.0%和96.4%，同时这两者之间的序列相似性为85.3%，表明德汉劳绵蟹2 和3 可能鉴定有误，不是真正的德汉劳绵蟹；遗传距离也证实了这一观点：德汉劳绵蟹2 和3 与本研究中的德汉劳绵蟹4 分别为0.180 和0.038，同时这两者之间的遗传距离为0.165，远大于种内个体间之间的遗传距离。绵蟹科未定种3 和4、海绵蟹Dromia erythropus和盲蟹D.personata以及德汉劳绵蟹3 和德汉劳绵蟹1 两两之间的序列相似性和遗传距离分别为98.8%和0.012、98.2%和0.019、96.6%和0.036，暗示这些物种分别隶属于同一个属。

表2 17 种绵蟹科物种线粒体COI 基因片段遗传距离(左下角)及序列相似性(右上角)Tab.2 The genetic distance (bottom left) and sequence similarity (upper right) based on COI fragment in 17 Dromiidae species

2.3 系统发育分析

以相手蟹科的无齿螳臂相手蟹C.dehaani和红螯螳臂相手蟹C.haematocheir为外类群，同时构建了绵蟹科的最大似然树(ML)、贝叶斯树(BI)和最大简约树(MP)。最大似然树与贝叶斯树拓扑结构十分接近，除了绵蟹科未定种7位置略有区别外，其余亲缘关系均一致；两者明显分为3 支：最先分出来的一支由Hypoconcha属与安地列斯绵蟹M.antillensis组成；德汉劳绵蟹2 与绵蟹科未定种3、4、5、7 和阿特拉斯平壳蟹组成一支并与其余物种组成的一支形成姐妹群。最大简约树中德汉劳绵蟹2 与阿特拉斯平壳蟹形成一支；绵蟹科未定种7 独立为一支；其余物种组成一支。不难发现3 种方法构建的系统发育树拓扑结构存在一定差异，且大部分节点支持率均较低，表明本研究中基于部分线粒体COI序列不适用于绵蟹科属间系统发育分析；但是在属内水平，3 种建树结果拓扑结构几乎完全一致，且均具有非常高的支持率(＞96)，如：同为绵蟹属Dromia的海绵蟹D.erythropus和盲蟹D.personata以及同为Hypoconcha属的粗糙负壳蟹H.arcuata和H.parasitica分别聚在一起，表现出很近的亲缘关系。结合COI序列相似性及遗传距离结果，德汉劳绵蟹1、3、4 三者之间的系统关系显示德汉劳绵蟹1 和4 为同一种类，而德汉劳绵蟹3 为鉴定错误，但能确定的是其仍为劳绵蟹属种类；系统树显示德汉劳绵蟹2 与本研究中的阿特拉斯平壳蟹聚为一支，但是没有跟劳绵蟹属的3 个物种(德汉劳绵蟹1、3、4)聚在一起，结果表明德汉劳绵蟹2 鉴定有误，但是仍不能确定其隶属哪个属；此外，系统树明显支持德汉劳绵蟹1 和4及绵蟹科未定种1 和6 分别为同一物种，与COI序列相似性及遗传距离结果吻合。

图3 基于线粒体COI 基因序列构建的绵蟹科最大似然树(A)、贝叶斯树(B)和最大简约树(C)Fig.3 Phylogenetic tree of Dromiidae species inferred from the COI sequence based on maximum likelihood (ML);Bayesian inference (BI) and maximum parsimony (MP) analysis

3 讨论

线粒体COI基因是用于物种鉴定非常有效的分子标记之一，尤其是对形态特征极其相似的隐存种以及形态界限模糊不清或者形态破损不易区分的近缘种的鉴定提供有效的分子依据，很大程度上弥补了形态分类的不足[6,9,30]。通常依据是计算种内和种间的遗传距离，通过比较两者之间是否有显著差异来判断某个物种的分类地位[31-33]。HEBERT,et al[13]最早比较分析了11 个主要门13 320 种动物的COI序列后提出COI基因用于物种鉴定的标准是种内遗传距离小于2%，且种间遗传距离显著大于种内遗传距离(通常10倍以上)。该观点在大量生物类群(如真菌、藻类、甲壳类、两爬类、鱼类和哺乳类等)均得到了验证[13,34-36]。如王淑英等[36]在研究鲽形目鳎科(Soleidae)鱼类物种鉴定时发现COI基因在种内和属内种间的平均遗传距离分别为0.33%和19.91%，两者遗传差异约为60 倍(个别最小相差19 倍)，符合HEBERT 提出的相差10 倍的物种鉴定标准；苗宪广等[21]在比较分析28 种舌鳎亚科鱼类COI基因序列时也发现舌鳎属部分种类之间的遗传距离已明显超出种之间的分化。本研究中，15 种绵蟹的种内遗传距离为0.2%～0.6%，平均遗传距离为0.4%，远小于HEBERT,et al[13]提出的2%标准；种间最小遗传距离为1.2%(存在于2 种绵蟹科未定种3 和4 之间)，最大遗传距离为21.6%，平均遗传距离为15%，为种内平均遗传距离的37.5 倍，大于HEBERT,et al[13]提出的10 倍标准，表明COI基因序列可以用于绵蟹科种类鉴定。

线粒体基因由于进化速率相对较快且不同基因进化速率不一致，使其成为系统进化研究十分理想的分子标记[37-39]。众多线粒体基因中，COI基因被广泛用于较低阶元(如属间、种间或群体水平等)系统进化分析，例如梁日深等[40]基于COI部分序列探讨了石斑鱼亚科Epinephelinae 中的10 属共40 种鱼类的系统亲缘关系，结果支持鳃棘鲈属Plectropomus为最原始的类群，石斑鱼属Epinephelus为最特化类群，驼背鲈属Cromileptes、光腭鲈属Anyperodon和宽额鲈属Promicrops等与石斑鱼属有着非常近的亲缘关系，暗示部分种类可能是石斑鱼属的特化类群；王秀亮等[41]分析了东海海域6 种常见梭子蟹之间的亲缘关系，结果表明蟳属与圆趾蟹属亲缘关系最近，两者聚为一支再与梭子蟹属聚在一起，为梭子蟹科的系统发育重建提供了重要的数据支持。本研究中不同方法构建的系统发育树在属间水平具有较明显的差异，而在属内水平，两者拓扑结构几乎完全一致，且支持率较高，表明本研究中COI基因因其有限的遗传信息位点仅适用于属内物种间系统关系分析，而对于较高阶元的属间亲缘关系则解析度不够。这也是为什么越来越多的研究趋向利用多个联合基因甚至线粒体基因组全序列来进行群体遗传及系统发育分析的原因[27-28,42]。针对具有较大分歧的属间亲缘关系，今后研究可以利用更多分子序列(多基因或者线粒体基因组全序列)以及更多代表种类来解决这些争议。