污泥基生物炭固定化菌处理海洋溢油的研究

陈 钰，曾广婷，刘 梅，汪佳欢，刘行平，竺柏康，陈庆国

(1.浙江海洋大学海洋科学与技术学院，浙江舟山 316022；2.浙江海洋大学石油化工与环境学院，浙江舟山 316022；3.舟山市污水处理有限公司，浙江舟山 316000)

伴随着海上石油的开发与运输，海上溢油事故时有发生，海洋石油污染问题一直是亟待解决的重大环境问题[1]。目前，海洋溢油污染治理方法主要分为物理、化学和生物修复技术。生物修复技术由于是实现石油无害化及实现生态恢复的唯一途径，在处理海洋溢油方面发挥了巨大作用[2]。其中，固定化微生物技术因其经济效益好、污染物去除效率高、可重复利用等优点已在溢油污染修复工程得到应用[3-4]。固定化微生物技术是指通过物理或化学方式将所需要的游离态微生物集中固定在某一特定载体内，使其在适宜的环境条件下保持生物活性并迅速增殖的方法[5]。相比于传统的微生物处理方法，该技术有效提高了特定菌种对环境中原油等污染物质的处理效率[6]。目前研究的热点和应用前景广泛的一种载体是生物炭，由于其优良的吸附性能和生物兼容性，在固定化微生物应用领域越来越得到重视[7]。生物炭来源广泛，可由各种废弃的有机生物质高温碳化获得。其中，污泥基生物炭，来源于常见的固废城市污泥，因具有高的比表面积和丰富的孔隙结构以及大量的官能团等特点，是污泥资源化利用的有效途径，已被应用于土壤和水污染治理与修复中[8-9]，包含重金属、氨氮和多环芳烃等多种污染物的去除[10-12]。因此，将污泥基生物炭固定化微生物应用于海洋溢油修复有望成为助力解决海洋石油污染的有力手段。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

城市污水厂脱水污泥，干燥、粉碎后保存备用；菌种为实验室保存的海洋石油烃降解菌Alcanivoraxsp.ASW-2；磷酸、无水硫酸钠等所用药剂均为分析纯。

1.2 培养基

肉汤培养基：蛋白胨10 g,牛肉膏3 g，NaCl 10 g,去离子水1 000 mL。

原油培养基：培养基配方按照文献[13]，原油添加量为0.1～5 g·L-1。

所有培养基均在121 ℃灭菌20 min 后使用，接种后的培养基置于振荡培养箱中120 r·min-1培养，除温度条件优化外，其余均为25 ℃恒温培养。

1.3 实验方法

1.3.1 生物炭载体制备

采用常用的生物炭活化剂磷酸对污泥进行活化[14]。以不同浓度的磷酸溶液(30%～60%)对经过预处理后的干燥污泥进行活化，将活化后污泥置于管式炉中(氮气保护)，进行单因素单水平实验，参考文献[15]生物炭制备条件，设定不同碳化温度(300～800 ℃)与碳化时间(0.5～2.5 h)，优化制备生物炭，获得制备污泥基生物炭的最优条件，同时根据扫描电镜与红外光谱分析制备的污泥基生物炭特性。

1.3.2 生物炭固定化微生物效果评价

将石油烃降解菌ASW-2 在肉汤培养基中富集培养3 d，对该菌进行离心制备菌悬浊液。该菌菌浓在5×108～5×1011CFU·mL-1之间OD600吸光度呈线性，获得线性方程菌浓y=8×1011x(OD600)-7×1010。根据吸光度调节配制菌浓为5×1011CFU·mL-1菌悬浊液，用1 g 制备的生物炭对50 mL 菌悬浊液吸附固定10 h，以吸附前后菌悬浊液的OD600值为评价指标[16]，考察不同条件下制备的生物炭对石油烃降解菌ASW-2 的吸附固定能力，进而优化生物炭制备条件。也通过单因素单水平实验考察不同菌浓的菌悬液(5×1010～5×1011CFU·mL-1)与不同吸附时间(2～30 h)对生物炭吸附固定降解菌效果的影响，优化降解菌ASW-2 固定化条件。

1.3.3 微生物降解原油实验

采用单因素单水平实验，考察固定化菌与游离菌在相同条件下对不同浓度的原油(0.1～5 g·L-1)的降解效率，探究降解效率随降解时间(0～15 d)的变化。设定不同盐度(10～40)、pH(6～9)、温度(5～35 ℃)条件下降解原油。初始实验条件为温度25 ℃、盐度30、pH 8，原油浓度为1 g·L-1降解7 d。实验按顺序进行，上一步实验优化后的实验条件作为下一步实验的设定条件。参考文献[17]方法，用紫外分光光度法(254 nm 波长)测定微生物降解前后培养基原油浓度变化，优化固定化菌的降解条件，并与游离菌的降解效果作对比。通过气相色谱仪(GC-FID)和气质联用仪(GC-MS)测定固定化微生物和游离微生物降解前后石油中主要的烃组分的变化[18]，以考察生物炭固定化微生物对石油各组分的降解特性。

2 结果与讨论

2.1 污泥基生物炭制备与微生物固定化条件优化

2.1.1 活化剂浓度与活化时间对生物炭吸附效果的影响

制备生物炭的碳化温度为600 ℃，碳化时间30 min，考察了活化剂磷酸的浓度及活化时间对生物炭吸附固定石油降解菌效果的影响，结果如图1 所示。由图1(a)可知，随磷酸浓度的升高，生物炭对石油降解菌的吸附量呈上升趋势，磷酸浓度由45%提升至50%时，生物炭的吸附效果得到显著提升，因为高浓度磷酸对污泥的润涨作用增强，加速了造孔速度。其中，磷酸浓度达到55%时生物炭的吸附能力最强，对石油降解菌的吸附量达到1.64×1011CFU·g-1。而磷酸进入污泥内部对污泥进行活化需要一定时间[19]，图1(b)表明活化时间与生物炭的吸附能力随活化时间增长先增加后减少。活化时间为2 h 时生物炭对石油降解菌的吸附量达到最大，吸附量为1.77×1011CFU·g-1。

图1 活化剂使用条件优化Fig.1 Optimization of activator conditions

2.1.2 碳化温度与碳化时间对生物炭吸附效果的影响

制备生物炭的活化剂浓度为55%，活化时间为2 h，考察了碳化温度及碳化时间对生物炭吸附固定石油降解菌效果的影响，结果见图2。由图2(a)可见，碳化温度为300～500 ℃时生物炭对石油降解菌的吸附效果呈上升趋势，碳化温度为550 ℃时，由于有机物大量挥发，生物炭表面逐渐形成比较完善的孔隙结构，比表面积增大，生物炭的吸附能力最强。碳化温度上升至600 ℃时，可能是由于生物炭孔隙结构由微孔变为中孔或大孔，导致比表面积减小，生物炭的吸附能力有所下降[20]。随着温度继续提高，污泥中少量无机物的分解和有机物之间的缩合使生物炭孔隙结构重新形成，使生物炭吸附效果有所提升。此结果与杨艳琴等[21]、王格格等[22]研究结果一致。由图2(b)可知，随着碳化时间的增长，生物炭对石油降解菌的吸附量先增后降，碳化时间为1 h 时生物炭的吸附效果最佳。因为污泥需要一定时间才能完全碳化，碳化不完全时生物炭孔隙结构不发达，吸附效果较差。1 h 后生物炭碳化完全，碳化时间继续延长，原本较完善的孔隙结构被破坏，生物炭吸附效果变差。

图2 碳化条件优化Fig.2 Optimization of carbonization conditions

2.1.3 生物炭固定化微生物条件优化

将优化条件下制备的生物炭进行微生物固定化条件优化，结果见图3。图3(a)表明，生物炭对石油降解菌的固定量整体随初始菌液浓度的提高而增长，当初始菌浓超过3×1011CFU·mL-1时生物炭固定量的提升速率有所下降。初始菌浓较低时菌悬液中的石油降解菌几乎都被生物炭所吸附，石油降解菌量限制了生物炭的吸附能力[23]。当初始菌浓增加时，生物炭的吸附能力得到快速提升，当初始菌浓为5×1011CFU·mL-1时生物炭对石油降解菌的吸附量最大，为1.94×1011CFU·g-1。

图3(b)可以看出，当初始菌浓为5×1011CFU·g-1时，0～12 h 时生物炭对石油降解菌的固定量随时间变化增长迅速，因生物炭的吸附能力有一定限度，12 h 后生物炭对石油降解菌的吸附基本达到饱和，固定化菌量达到2.06×1011CFU·g-1，随时间继续增长，生物炭吸附的菌量基本保持恒定，甚至略有下降。此趋势与秦丽姣[24]在探究不同时间下载体材料对石油降解菌吸附量的研究结果一致。

图3 生物炭吸附固定化菌条件优化Fig.3 Optimization of conditions for biochar adsorbed immobilization of bacteria

2.2 制备的生物炭的性能表征

2.2.1 SEM 表征

污泥样品处理前后的扫描电镜图如图4 所示：磷酸活化后，污泥呈现明显的层状结构，增大了比表面积，提供大量吸附位点，使其吸附性能增强[25]。在培养基中培养一段时间后，细菌在污泥基生物炭内部生长，并分泌出较多的如多糖、蛋白质等生物大分子代谢产物分布在污泥基生物炭表面使其表面变得很光滑。制备的磷酸活化改性的生物炭比表面积为29.13 m2·g-1，总孔体积为0.043 m2·g-1，平均孔径为12.32 nm，与文献[21]制备的生物炭性能相当。

图4 样品SEMFig.4 SEM image of samples

2.2.2 红外光谱表征

如图5 所示，污泥高温碳化后，1 424 cm-1(缔合态的酰胺基吸收峰)、870 cm-1(伯胺的NH 面外弯曲振动峰)，相对于未碳化样品吸收峰显著增强，说明含氮有机质在高温下发生聚合。3 744 cm-1、710 cm-1也出现了较为明显的吸收峰，为-OH的振动峰，是氢键缔合产生的吸收峰，特别是预处理中使用H3PO4活化污泥引入-OH 后吸收峰较为明显增强。H3PO4活化后生物炭样品中吸收峰(1 034 cm-1，C-O-C 伸缩振动峰；560 cm-1，芳香酮类羰基振动峰)相对于直接高温碳化的吸收峰显著增强[26]，说明磷酸活化后使制备的生物炭活性官能团明显增多。

图5 污泥样品与不同处理制备的生物炭的FTIR图谱Fig.5 FTIR spectra of sludge samples and biochar prepared by different treatments

2.3 固定化微生物降解原油的特性与环境条件优化

2.3.1 固定化载体对原油的吸附贡献

设定初始固定化载体添加量为1 g·L-1，原油浓度为1 g·L-1，考察固定化载体添加量及原油浓度对生物炭载体去除原油影响，结果如图6 所示。由图6 可以看出，随着载体添加量的增加，载体对原油的吸附率有所提升，但整体吸附效果不佳，而原油浓度与载体吸附率之间未呈现明显相关性。固定化载体对油吸附的贡献较小，对原油的吸附率均在5%以下，结合固定化菌对原油降解率数据可以看出，固定化菌对原油的去除主要是生物降解贡献。在不同原油浓度条件下，微生物对原油的降解率可达32%～90%。而且，扣除吸附贡献，固定化载体的添加也显著促进了生物降解，载体固定化后微生物对不同浓度原油的降解效果可提升8%～17%。

图6 生物炭载体对原油去除影响Fig.6 Effect of biochar carrier on crude oil removal

2.3.2 原油浓度与降解时间对固定化微生物降解原油的影响

考察了原油浓度与降解时间对固定化微生物降解原油的影响，结果如图7 所示。如图7(a)所示，固定化菌与游离菌对原油的降解率均随原油浓度的升高而下降，高浓度原油对石油降解菌有一定抑制作用。原油浓度为0.1 g·L-1时，降解7 d，固定化菌与游离菌对原油的降解效果最佳，降解率分别为97.78%与90.24%。而随着浓度增加，原油的抑制效果逐渐增强，5 g·L-1的高浓度原油条件下降解率分别降至50%和35%以下。陈曦等[27]研究也表明石油浓度过高，限制微生物对营养物质的吸收，甚至对石油降解菌产生毒害作用。与游离菌相比，固定化提升了微生物对原油的降解效率，在原油浓度为1 g·L-1，固定化对微生物降解的促进作用最为显著，提升降解率可达17.23%；设定原油浓度为1 g·L-1时，考察了微生物对原油的降解率随降解时间的变化，结果如图7(b)所示。如图7(b)所示，微生物对原油的降解率随降解时间的增长先增加后趋于平稳。第7 天时固定化菌对原油的降解率趋于稳定，为75.87%，比游离菌高23.98%。游离菌对原油的降解在第9 天趋于稳定，降解率为56.67%。与游离菌相比，固定化加快了微生物对原油的降解速率，提高了石油烃降解菌对原油的降解效果。已有文献已报道利用各种材料吸附固定化降解菌提高对石油的生物降解效率。宋佳宇等[28]利用改性聚丙烯工业吸油棉吸附固定化石油降解菌，相比游离菌，18 d 降解后固定化菌对1 g·L-1的原油去除率为70.01%，比游离菌提高20%左右；韩志勇等[29]利用核桃壳吸附固定石油烃降解菌，在原油浓度为3.9 g·L-1、固定化菌7 d 对原油降解率达到66.8%。ZHOU Hanghai,et al[30]利用玉米秸秆生物炭固定化石油烃降解菌降解燃料油，对1%的燃料油7 d 降解率可达94.7%，比游离菌提高40.3%。以上研究表明，生物炭在促进原油生物降解方面具有明显优势。

图7 原油浓度与降解时间对固定化菌降解原油的影响Fig.7 Effects of crude oil concentration and degradation time on crude oil degradation by immobilized bacteria

2.3.3 环境条件对固定化微生物降解原油的影响

利用固定化菌和游离菌对1 g·L-1原油降解7 d，考察在实验设定的环境条件(温度、盐度、pH)变化范围内，温度、盐度、pH 对固定化菌和游离菌降解原油效率的影响，结果如图8 所示。如图8 所示，随着温度、盐度、pH 的增加，降解菌对原油的降解率均呈现先上升后下降的趋势。微生物对这些环境因素有一定耐受范围，超过耐受范围后微生物对原油的降解效果明显下降[31]。菌降解原油的最适温度为25 ℃，高温与低温对微生物降解原油产生一定抑制作用，但固定化对温度抑制作用有一定程度减弱；盐度为30 时，菌对原油的降解效果最佳，盐度为10～30 时固定化对菌原油降解率的提升效果较好，当盐度继续上升时由于高盐度的抑制作用，固定化的提升效果有所下降；固定化菌与游离菌的最适pH 分别为7.5 与8，pH 改变时固定化菌原油降解率的变化较小，说明固定化显著提升了菌对pH 的耐受性。田秀梅等[32]的研究也表明，pH为7～8 时固定化菌对石油的去除效果较佳，pH 过低或过高都会影响微生物的生长繁殖和酶的活性。固定化提升了石油降解菌对环境的耐受性，在相同环境条件下，经过7 d 降解，固定化后菌对原油的降解率最大可达78.71%，与游离菌相比降解效率可提升约28%。

图8 环境条件对固定化菌降解原油的影响Fig.8 Effects of environmental conditions on degradation of crude oil by immobilized bacteria

2.3.4 微生物对正构烷烃与多环芳烃的降解

游离菌和固定化菌降解原油7 d 后的样品(未接种的原油培养基做空白)，利用GC-FID 和GC-MS 测定油样品中主要烷烃组分(C10-C32)和芳烃组分(16 种海洋中常见的多环芳烃)变化[33]如图9 所示。如图9所示看出，降解菌ASW-2 对正构烷烃和多环芳烃均有一定降解去除。降解菌ASW-2 对正构烷烃(C12-C32)的降解作用(37.4%)显著高于多环芳烃(23.5%)。而污泥基生物炭固定化菌显著提高了石油降解菌对正构烷烃和多环芳烃的去除，污泥基生物炭固定化菌对正构烷烃去除率可达51.3%，去除率提高13.9%；对多环芳烃去除率可达28.8%，去除率提高5.3%。污泥基生物炭固定化菌对于中短链烷烃特别是C28 以下烷烃去除效果提高显著，而对于长链烷烃去除效果(C28 以上)提高效果小于中短链烷烃，污泥基生物炭固定化菌对于多环芳烃中含量较高的三环和四环的多环芳烃，如苊、蒽、荧蒽去除具有较明显的提高效果，这与KUMARI S,et al[34]的研究结果一致。

图9 降解前后主要原油组分变化Fig.9 Changes of main components of crude oil before and after degradation

3 结论

本论文探究了污泥基生物炭制备、吸附固定化微生物与微生物降解原油条件的优化，并考察了固定化微生物降解原油的特性，得出以下结论：

(1)55%磷酸活化2 h 并在500 ℃条件下碳化1 h 后制得的生物炭具有良好的孔隙结构和较大的比表面积，吸附效果较好，对石油降解菌的吸附量最大可达1.77×1011CFU·g-1。

(2)生物炭固定化微生物的最优初始游离菌浓为5×1011CFU·g-1，在此菌浓条件下吸附12 h 后，生物炭对微生物的吸附达到稳定，吸附量可达2.06×1011CFU·g-1。

(3)在pH 为8，盐度为30，温度为25 ℃的环境条件下，固定化菌对原油的降解效果最佳。在最优环境条件下降解7 d 后，固定化菌对1 g·L-1原油的最大降解率可达78.71%。

(4)与游离微生物相比，生物炭固定化后的微生物对原油的降解能力更强，且对环境有更强的耐受性。生物炭固定化显著提高了石油降解菌对正构烷烃和多环芳烃的去除，正构烷烃去除率提高13.9%，多环芳烃去除率提高5.3%。